Введение
Глава I. Обзор литературы. Молекулярные маркеры онкогематологических заболеваний 14
1.1. Методы молекулярной диагностики онкогематологических заболеваний 14
1.2. Общие принципы молекулярной диагностики онкогематологических заболеваний 15
1.3. Аномалии хромосом при онкогематологических заболеваниях 22
1.3.1 Активация онкогенов в результате сближения с последовательностями других генов 24
1.3.2 Малигнизация при участии химерных генов 28
1.4. Прогностическое значение генетических дефектов при онкогематологических заболеваниях 35
1.4.1. Цитогенетические и молекулярно-генетические факторы прогноза острых миелобластных лейкозов 36
1.4.1.1 Цитогенетические факторы прогноза ОМЛ 39
1.4.1.2 Молекулярно-генетические факторы прогноза ОМЛ 41
1.4.2 Цитогенетические и молекулярно-генетические факторы прогноза острых лимфобластных лейкозов 47
1.5. Молекулярный патогенез и диагностика хронических миелопролиферативных заболеваний 58
1.5.1. Классические хронические миелопролиферативные заболевания 58
1.5.2. Молекулярный механизм эритропоэза 60
1.5.3 Молекулярный патогенез наследственных хМПЗ 64
1.5.4 Молекулярный патогенез классических Ph-негативных хМПЗ 65
1.5.5 Редкие варианты МПЗ 71
1.5.6. Химерные онкогены, образованные из генов, кодирующих тирозинкиназы 73
1.5.7. Молекулярная диагностика МПЗ 74
1.6. Молекулярный патогенез и диагностика хронического миелолейкоза .75
1.6.1 Ген BCR-ABL1 при хроническом миелолейкозе 75
1.6.2 Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза 77
1.7. Генетические аномалии при множественной миеломе 82
1.8. Молекулярные особенности медиастинальной лимфомы 85
1.9. Экспрессия гена WT1 при гемобластозах 88
1.10. Экспрессия раково-тестикулярных генов при гемобластозах 90
1.11. Стандартизация молекулярной диагностики онкогематологических заболеваний 98
Глава 2. Материалы и методы исследования 101
2.1 Характеристика больных 101
2.2 Методы исследования 105
2.2.1 Состав буферных растворов 105
2.2.2 Выделение ядерных клеток крови и костного мозга 106
2.2.3 Выделение фракции чистых гранулоцитов 107
2.2.4 Выделение РНК 107
2.2.5 Выделение геномной ДНК 108
2.2.6 Синтез олигонуклеотидов 108
2.2.7 Реакция обратной транскрипции. 109
2.2.8 Полимеразная цепная реакция 109
2.2.9 Выделение ПЦР-продуктов из гелей 110
2.2.10.1 Обработка данных ПЦР в реальном времени 111
2.2.10.2 Проверка воспроизводимости результата 112
2.2.10.3 Проверка специфичности работы систем 112
2.2.11 Секвенирование ДНК 112
2.2.12 Создание контрольных плазмид для ПЦР в реальном времени 113
2.2.13 Определение мутаций в гене BCR-ABL1 113
Глава 3. Результаты и обсуждение 116
3.1.1 Разработка тест-систем для анализа экспрессии химерных онкогенов – маркеров гемобластозов на основе ПЦР 116
3.1.2 Разработка тест-систем на основе ПЦР для определения мутаций, характерных для онкогематологических заболеваний 121
3.1.3 Разработка тест-систем для количественного анализа экспрессии химерных онкогенов – маркеров гемобластозов на основе ПЦР в реальном времени 123
3.1.4 Разработка тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения мутаций, в том числе для количественного расчета аллельной нагрузки мутантных генов 125
3.2.1 Стабильность положительных контролей (стандартов) 126
3.2.2 Воспроизводимая чувствительность тест-системы по контрольным плазмидам 128
3.2.3 Чувствительность метода по разведениям РНК 129
3.2.4 Чувствительность и воспроизводимость метода по разведениям клеточных линий 130
3.2.5 Стандартизация метода ПЦР в реальном времени, применяемого для молекулярного мониторинга экспрессии BCR-ABL1 132
3.2.6 Сравнение значений цитогенетического и молекулярного ответа 134
Заключение 205
Выводы 211
Список литературы 213
Список сокращений 264
Приложение 1. Праймеры и зонды, разработанные и использованные в данной работе 266
Приложение 2. Иструкция по применению набора для определения экспрессии химерного онкогена BCR-ABL1 p210 методом ОТ ПЦР. 269
Приложение 3. Иструкция по применению набора для определения экспрессии химерного онкогена BCR-ABL1 p210 методом ПЦР в реальном времени 273
