Введение
Общая характеристика работы 6
1. Обзор литературы 13
1.1 Болезнь Паркинсона, общая информация 13
1.1.1 История изучения БП 13
1.2 Альфа-синуклеин 21
1.2.1 Альфа-синуклеин в дофаминовой нейротрансмиссии 24
1.2.2 Альфа-синуклеинопатии 31
1.2.3 Болезнь Паркинсона – форма альфа-синуклеинопатии. 32
1.2.4 Деменция с рассеянными тельцами Леви 37
1.2.5 Мультисистемная атрофия. 39
1.2.6 Болезнь Галевронда-Шпатца
1.3 Моделирование альфа-синуклеинопатий в генетически модифицированных животных 43
1.4 Формирование популяций дофаминергических нейронов 50
2. Материалы и методы исследования 56
2.1 Экспериментальные животные 56
2.2 Генотипирование животных.
2.2.1 Конвенционная полимеразная цепная реакция 58
2.2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле. 61
2.2.3 ПЦР в реальном времени 61
2.2.4 Анализ уровня экспрессии РНК. 63
2.2.5 Анализ белков. Приготовление образцов для анализа тотального белка. 64
2.2.6 Денатурирующии гель-электрофорез. 65
2.2.7 Иммуноблоттинг 65
2.2.8 Антитела 66
2.3 Исследование пролиферативной активности. 67
2.3.1 Введение 5-бром-2 -дезоксиуридина 67
2.3.2 Идентификация BrdU-положительных клеток. 67
2.4 Приготовление гистологических препаратов 67
2.4.1 Фиксация эмбрионов мыши. 67
2.4.2 Фиксация тканей мозга мышей раннего постнатального возраста. 68
2.4.3 Фиксация тканей мозга взрослых мышей. 68
2.5 Имммуногистохимическое окрашивание. 69
2.6 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов в ядрах среднего мозга. 71
2.7 Статистическая обработка данных. 73
3. Результаты исследования и их обсуждение 74
3.1 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у мышей с конститутивной инактивацией гена альфа-синуклеина
3.1.1 Анализ развивающихся дофаминергических нейронов Чёрной субстанции (ЧС) и Вентральной области покрышки (ВОП) в эмбриогенезе. 76
3.1.2 Анализ дофаминергических нейронов чурной субстанции и вентральной области покрышки в раннем постнатальном периоде. 85
3.2 Разработка линии мышей для регулируемого тканеспецифичного нокаута гена альфа-синуклеина . 87
3.2.1 Характеристика исходной линии [SNCAflox/flox neoFRT/+].90
3.2.1.1 Анализ уровня альфа-синуклеина в тканях мышей линии [SNCAflox/flox neoFRT/+] 90
3.2.1.2 Удаление гена neo из генома [SNCAflox/flox neoFRT/+ ] мышей с помощью FRT рекомбинации. 92
3.2.1.3 Новый генетический нокаут. Конститутивное удаление
второго экзона гена альфа-синуклеина из генома
SNCAflox neo/flox пео мышей с помощью Cre-рекомбинации 96
3.3 Анализ формирования популяций дофаминергических нейронов у мышей новой линии SNCADflox/=flox 100
3.3.1 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у SNCADflox/Dflox мышей в эмбриогенезе 100
3.3.2 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у SNCADflox/Dflox мышей в раннем постнатальном развитии 104
3.3.3 Морфометрический анализ дофаминергических нейронов у взрослых SNCADflox/=flox мышей 104
3.4 Анализ уровня экспрессии гена мультимерина-1, располагающегося в промоторной области альфа-синуклеинаЮб
Практические рекомендации 113
Список использованной литературы 117
