ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................................... 11
1.1 Ретиноевая кислота: основные функции и механизмы внутриклеточной активности ........... 11
1.2 Неканоническая активность РК .................................................................................................... 17
1.3 Белки, связывающие РК ................................................................................................................ 20
1.4 CRABP1 и CRABP2, строение и функции ................................................................................... 21
1.5 Роль CRABP1 и CRABP2 в канцерогенезе .................................................................................. 27
1.5.1 CRABP2 в клетках злокачественных опухолей ...................................................................... 27
1.5.2 CRABP1 в клетках злокачественных опухолей ....................................................................... 30
1.6 Гипотезы формирования резистентности клеток к РК ............................................................... 36
1.6.1 Гипотеза нарушения классического ретиноевого сигналинга ................................................ 37
1.6.2 Участие коактиваторов - белков семейства iLBP, связывающих РК ..................................... 41
1.6.3 Изменение метаболизма РК ....................................................................................................... 42
1.6.4 Гипотеза связи неканонической активности РК с РК-чувствительностью клеток ............... 43
1.7 Рак молочной железы и РК-чувствительность (Выбор модели) ............................................... 44
1.8 Заключение ..................................................................................................................................... 46
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................. 47
2.1 Клеточные линии и условия культивации ................................................................................... 47
2.2 Выделение плазмидной ДНК ........................................................................................................ 47
2.3 Трансформация компетентных клеток E. coli ............................................................................. 48
2.4 Трансфекция ................................................................................................................................... 49
2.5 Инфекция псевдовирусными частицами ..................................................................................... 50
2.6 Приготовление клеточных лизатов .............................................................................................. 51
2.7 Иммуноблоттинг ............................................................................................................................ 51
2.8 Исследование клеточных характеристик in vitro. Анализ динамики роста клеток ................. 52
2.9 Обработка клеток ATRA ............................................................................................................... 53
2.10 Проточная цитофлуориметрия .................................................................................................... 54
2.11 Выделение тотальной РНК .......................................................................................................... 55
2.12 Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени ................................................................ 56
2.13 Оценка влияния ингибиторов ДНК-метилтрансферазы и HDAC на экспрессию генов ....... 57
2.14 Выделение ДНК из клеток .......................................................................................................... 58
2.15 Бисульфитное секвенирование ................................................................................................... 58
2.16 Статистическая обработка результатов ..................................................................................... 60
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ .................................................................................................................... 61
3
3.1 Исследование уровня чувствительности малигнизированных клеток к ретиноевой кислоте и возможной связи экспрессии белков CRABP с РК-резистентностью ............................................ 61
3.1.1 Сравнение чувствительности к ретиноевой кислоте опухолевых клеток различного происхождения ..................................................................................................................................... 61
3.1.2 Экспрессия CRABP в РК-чувствительных и РК-резистентных клетках опухолей различного происхождения ................................................................................................................. 62
3.1.3 Исследование связи чувствительности к ретиноевой кислоте с экспрессией CRABP1 в клетках рака яичника ........................................................................................................................... 64
3.1.4 Сравнение чувствительности к ретиноевой кислоте клеток рака молочной железы ........... 67
3.1.5 Исследование механизмов рост-ингибирующей активности АТRА в клетках рака молочной железы с разной чувствительностью к ретиноевой кислоте .......................................... 69
3.1.6 Анализ продукции белков CRABP1 и CRABP2 в клетках рака молочной железы .............. 73
3.1.7 Анализ уровня мРНК CRABP1 и CRABP2 в линиях клеток рака молочной железы с различным уровнем чувствительности/резистентности к ретиноевой кислоте ............................. 77
3.1.8 Анализ влияния деметилирования ДНК и ингибирования деацетилирования гистонов на экспрессию CRABP1 ............................................................................................................................ 78
3.2 Исследование роли белков CRABP1 и CRABP2 в регуляции пролиферации и чувствительности к ретиноевой кислоте клеток рака молочной железы ....................................... 81
3.3 Анализ экспрессии ядерных рецепторов ретиноевой кислоты, RARα и RARβ, в клетках рака молочной железы с разным уровнем чувствительности к ретиноевой кислоте ............................ 90
3.4 Анализ экспрессии цитохромов CYP26A1 и CYP26В1 в клетках рака молочной железы с разным уровнем чувствительности к ретиноевой кислоте .............................................................. 92
3.5 Исследование неканонической активности ретиноевой кислоты в отношении активации протеинкиназ AKT и ERK1/2 в трансформированных клетках с разным уровнем чувствительности к ретиноевой кислоте и экспресcии CRABP1 .................................................... 94
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ....................................................... 98
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 114
ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................ 115
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ..................................................... 116
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................................. 117
