Введение
Цели и задачи исследования 8
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Общие представления о болезни Альцгеймера 10
1.2. Предшественник амилоидного пептида, его свойства и функции 13
1.3. Протеолитический процессинг предшественника амилоидного пептида 17
1.4. Свойства амилоидного пептида 23
1.5. Выведение Ар из организма и мозга 26
1.6. Амилоид-деградирующие ферменты 26
1.6.1. Неприлизин 27
1.6.2. Эндотелин-конвертирующий фермент 31
1.6.3. Инсулин-деградирующий фермент 34
1.6.4. Плазмин 39
1.6.5. Другие агенты 41
1.7. Динамичность уровня содержания А{3 42
1.8. Факторы, влияющие на баланс Ар 45
1.8.1. Возраст 45
1.8.2. Гипоксия и ишемия мозга 48
1.8.3. Пренатальная гипоксия 51
1.9. Современные подходы к лечению болезни Альцгеймера 55
1.10. Обоснование целей и задач данного исследования 58
Глава 2. Экспериментальные модели и методы исследования 60
2.1. Материалы 60
2.2. Модели гипоксии 61
2.2.1. Модель пренатальной нормобарической гипоксии 61
2.2.2. Модели острой гипоксии взрослых животных 62
2.2.2.1. Модель нормобарической гипоксии 62
2.2.2.2. Модель гипобарической гипоксии 63
2.2.3. Модель гипоксии культивируемых нервных клеток 63
2.3. Модель экспериментальной ишемии мозга крыс 63
2.4. Метод культивирования нервных клеток 64
2.4.1. Культивирование клеток нейробластомы человека 64
2.4.2. Получение и культивирование первичных нейрональных клеток из мозга новорожденных крыс 65
2.4.3. Оценка выживаемости клеток в культуре с помощью окрашивания трипановым голубым
2.5. Выделение фракций растворимых и мембраносвязанных белков методом дифференциального центрифугирования 67
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле 69
2.7. Исследование уровня экспрессии белков с помощью метода иммуноблотинга 69
2.8. Методы анализа экспрессии белков с использованием иммуноцитохимии и флуоресцентной конфокальной микроскопии... 71
2.9. Исследование уровня экспрессии белков на уровне мРНК с помощью методов полимеразной цепной реакции 72
2.9.1. Выделение РНК и определение содержания нуклеиновых кислот 72
2.9.2. Электрофорез в агарозном геле 72
2.9.3. Проведение одноэтапной полимеразной цепной реакции с помощью обратной транскриптазы 73
2.9.4. Количественная полимеразная цепная реакция 73
2.10. Анализ активности а-секретазы с использованием клеток нейробластомы человека 74
2.11. Флуоресцентный метод определения активности неприлизнна.. 74
2.12. Метод определения активности ацетилхолинэстеразы 75
2.13. Методы определения содержания белка 77
2.14. Анализ влияния кортикальных инъекций ингибитора а-секретазы батимастата на формирование памяти у крыс 78
2.15. Статистические методы обработки полученных данных 79
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 82
3.1. Возрастные изменения экспрессии АРР и продукции его растворимых фрагментов в норме и после пренатальнои гипоксии 82
3.2. Возрастная динамика экспрессии амилоид-деградирующего фермента НЕП и ЕСЕ-1 в норме и после пренатальнои гипоксии 88
3.3. Влияние острой нормобарической гипоксии у взрослых животных на экспрессию АРР и активность ферментов, участвующих в его метаболизме 95
3.4. Влияние острой гипобарической гипоксии на активность НЕП в коре и гиппокампе крыс 98
3.5. Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию ферментов, участвующих в метаболизме АРР 100
3.6. Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию амилоид- деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1 в коре мозга крыс 107
3.7. Влияние специфического ингибитора а-секретазы на формирование памяти у крыс
3.8. Анализ участия а-секретазы предшественника амилоидного пептида в секреций растворимой формы ацетилхолинэстеразы 113
3.9. Влияние гипоксии и окислительного стресса на активность и экспрессию амилоид-деградирующих ферментов в клетках нейробластомы человека 122
3.10. Влияние гипоксии на активность и экспрессию НЕП в первичных культурах нейрональных клеток мозга крыс 133
3.11. Поиск путей регуляции активности амилоид-деградирующих, ферментов 135
Глава 4. Общая оценка результатов исследования 140
Заключение 144
Выводы 146
Слова благодарности 148
Список цитируемой литературы 149
