Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Общие представления о миграции и инвазии клеток 12
1.1.1. Миграция клеток 12
1.1.2. Инвазия клеток 16
1.2.Общая характеристика цитозольного белка теплового шока 90 (Hsp90)
1.2.1. Общая характеристика и классификация белков теплового шока 19
1.2.2. Общая характеристика Hsp90 19
1.2.3. Структурная организация Hsp90 и конформационый цикл 20
1.2.4. Шаперонный комплекс Hsp90 и его функционирование 23
1.2.5. Физиологическая роль внутриклеточного Hsp90 24
1.3. Экстраклеточный белок теплового шока 90 (Hsp90) 26
1.3.1. Секреция и мембранная экспрессия Hsp90 27
1.3.2. Роль экстраклеточного Hsp90 в ранозаживлении 30
1.3.3. Роль экстраклеточного Hsp90 в развитии опухолевого процесса 32
1.3.4. Механизмы действия экстраклеточного Hsp90 34
1.4. Поверхностные клеточные гепарансульфат протеогликаны 37
1.4.1. Общая характеристика и структура гепарансульфат протеогликанов 37
1.4.2. Функционирование и биологическая роль клеточных ГСПГ 40
1.5. Заключение по обзору литературы 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Химические реактивы, среды и материалы 44
2.2. Животные 45
2.3. Очистка белков теплового шока Hsp90 и Hsp70 45
2.3.1. Очистка суммарного Hsp90 из ткани мозга животных 45
2.3.1.1. Приготовление тиофильного геля 45
2.3.1.2. Приготовление гомогената ткани 45
2.3.1.3. Фракционирование с помощью сульфата аммония 45
2.3.1.4. Хроматография Hsp90 на тиофильном геле 46
2.3.1.5. Ионообменная хроматография Hsp90
2.3.2. Иммуноаффинная очистка двух изоформ Hsp90 46
2.3.3. Флюорохромирование нативного Hsp90 47
2.3.4. Очистка белка теплового шока 70 47
2.4. Получение Hsp90-специфических поликлональных антител 47
2.4.1. Синтез пептидов и получение конъюгатов пептидов с белками 47
2.4.2. Получение Hsp90-специфических иммуноаффинных носителей 44
2.4.2.1. Конъюгирование нативного Hsp90 с нерастворимыми носителями
2.4.2.2. Конъюгирование Hsp90-специфических пептидов с нерастворимыми
носителями 48
2.4.3. Иммунизация кроликов и анализ гипериммунных сывороток 48
2.4.4. Иммуноаффинная очистка Hsp90-специфических антител
2.4.4.1. Предварительное фракционирование кроличьих антисывороток 49
2.4.4.2. Иммуноаффинная очистка Hsp90-специфических антител 49
2.4.5. Очистка контрольных поликлональных антител из сывороток неиммунизированных кроликов 49
2.5. Определение концентрации белков 50
2.6. Электрофорез белков 50
2.7. Вестерн-блот анализ 50
2.8. Иммуноферментные методы
2.8.1. Непрямой ИФА 51
2.8.2. Конкурентный ИФА 51
2.9. Связывание Hsp90 с гепарин-сефарозой 52
2.10. Культивирование клеток 52
2.11. Определение токсичности и антипролиферативной активности препаратов 52
2.11.1. Подготовка образцов очищенных белков и Hsp90-специфических антител для анализа на клеточных культурах 53
2.11.2. Определение прямой цитотоксичности препаратов 53
2.11.3. Оценка антипролиферативной активности препаратов 53
2.12. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 53
2.12.1. Иммунофлуоресцентное окрашивание внутриклеточных белков 54
2.12.2. Иммунофлуоресцентное окрашивание мембранных белков
2.12.2.1. Метод конфокальной микроскопии 54
2.12.2.2. Метод проточной цитофлуориметрии 54
2.12.3. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание мембранных белков 55
2.13. Изучение влияния различных ингибиторов и ферментов на мембранную экспрессию Hsp90 56
2.13.1. Обработка клеток хлоратом натрия 56
2.13.2. Обработка клеток смесью гепариназ I/III 56
2.13.3. Обработка клеток сульфированными гликозаминогликанами 57
2.13.3.1. Определение чувствительности мембрана-ассоциированных Hsp90 к 57
сульфированным гликозаминогликанам
2.13.3.2. Восстановление мембранной экспрессии Hsp90 после обработки 57
клеток гепарином
2.13.4. Обработка клеток ингибиторами синтеза и секреции белков 58
2.14. Определение миграции клеток in vitro 58
2.14.1. Определение неиндуцированной миграции клеток путем измерения скорости зарастания экспериментальной раны 58
2.14.2. Определение неиндуцированной миграции клеток с помощью вкладышей с полупроницаемой мембраной 59
2.14.3. Оценка Hsp90-индуцированной миграции клеток путем измерения скорости зарастания экспериментальной раны 60
2.14.4. Оценка Hsp90-индуцированной миграции клеток с помощью вкладышей с полупроницаемой мембраной 60
2.15. Определение инвазии клеток in vitro 61
2.15.1. Определение неиндуцированной инвазии клеток 61
2.15.2. Определение Hsp90-индуцированной инвазии клеток с помощью вкладышей с полупроницаемой мембраной 61
2.16. Изучение влияния различных ингибиторов и ферментов на миграцию и инвазию клеток 61
2.16.1. Обработка клеток хлоратом натрия 62
2.16.2. Обработка клеток смесью гепариназ I/III 62
2.16.3. Влияние сульфированных гликозаминогликанов, сополимера 2,5-ДГБК-желатин, ингибитора MK-2206 на миграцию и инвазию клеток
2.17. Определение уровня фосфорилирования Akt 63
2.18. Статистический анализ данных 63
ГЛАВА 3. Результаты исследований 64
3.1. Получение и характеристика очищенного нативного Hsp90 и отдельных изоформ Hsp90 и Hsp90 64
3.1.1. Получение и характеристика очищенного нативного суммарного Hsp90 64
3.1.1.1. Разработка метода очистки препарата суммарного Hsp90 с использованием тиофильного геля 64
3.1.1.2. Очистка и физико-химическая характеристика суммарного Hsp90 66
3.1.2. Очистка и физико-химическая характеристика двух изоформ Hsp90 67
3.2. Получение и характеристика Hsp90-специфических поликлональных антител 70
3.2.1 Получение пептидных конъюгатов для иммунизации животных 70
3.2.2 Получение Hsp90-специфических антител 70
3.3. Экспрессия двух изоформ Hsp90 и рецепторов Hsp90 на плазматической клеточной мембране 74
3.3.1. Экспрессия Hsp90 и Hsp90 на плазматической мембране 74
3.3.2. Экспрессия LRP1 и HER2 на плазматической мембране 76
3.4. Роль двух изоформ мембрана-ассоциированного и свободного Hsp90 в миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro 78
3.4.1. Исследование роли двух изоформ мембрана-ассоциированного Hsp90 в миграции и инвазии клеток in vitro 79
3.4.2. Исследование роли двух изоформ свободного Hsp90 в миграции и инвазии клеток in vitro 81
3.5. Участие клеточных гепарансульфат протеогликанов в связывании двух изоформ Hsp90 на поверхности клеточной мембраны 84
3.5.1. Связывание Hsp90 с иммобилизованным гепарином 84
3.5.2. Изучение роли поверхностных клеточных гепарансульфат протеогликанов в заякоривании двух изоформ Hsp90 плазматической клеточной мембране 85
3.5.3. Восстановление мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 после обработки клеток хлоратом натрия, смесью гепариназ I/III и гепарином 92
3.5.4. Изучение роли поверхностных клеточных ГСПГ в связывании свободного Hsp90 на плазматической мембране 95
3.5.5. Специфичность связывания Hsp90 и Hsp90 с поверхностными клеточными ГСПГ 97
3.6. Роль клеточных гепарансульфат протеогликанов в миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro 98
3.6.1. Участие клеточных ГСПГ в неиндуцированной миграции и инвазии клеток 98
3.6.2. Участие клеточных ГСПГ в Hsp90-индуцированной миграции и инвазии клеток 100
3.6.3. Исследование роли поверхностных клеточных ГСПГ в трансдукции сигнала от Hsp90 внутрь клетки 102
3.7. Изучение транслокации двух изоформ мембрана-ассоциированного Hsp90
на плазматическую мембрану 105
3.8. Экспрессия на плазматической мембране двух изоформ Hsp90 в клетках, находящихся в различных физиологических состояниях 108
3.8.1. Экспрессия двух изоформ Hsp90 в клетках на границе повреждения клеточного монослоя 109
3.8.2. Уровень мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 в клетках, находящихся на разных фазах клеточного роста 110
3.8.3. Уровень мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 в клетках в бессывороточной среде, при активации клеток ЭБС или нативным Hsp90 111
3.8.4. Латеральное перераспределение двух изоформ Hsp90 на плазматической клеточной мембране между гепарин-чувствительными и гепарин-устойчивыми комплексами 114
Заключение 117
Выводы 125
Список основных публикаций по теме диссертации
