Введение
1. Процесс прикрепления хромосом к микротрубочкам веретена деления .
1.1 Организация митотического веретена деления 9
1.2 Инициация взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами митотических хромосом 10
1.3 Передвижение хромосом во время прометафазы 14
1.4 Динамика микротрубочек веретена деления в процессе митоза 17
2. Механизм передвижения митотических хромосом.
2.1 Роль белков-биологических моторов в процессе передвижения хромосом 19
2.2 Турновер микротрубочек в процессе передвижения хромосом 23
3. Значение взаимодействия между микротрубочками и кинетохорами в регуляции митотической прогрессии.
3.1 Точка перехода митоза 28
3.2 Сборка компонентов системы точки перехода на кинетохоре 32
3.3 Динамика компонентов митотической точки перехода 36
4. Кинетохорассоциированный белок Е (CENP-E).
4.1 Роль белка CENP-E в передвижении хромосом во время митоза 40
4.2 Роль белка CENP-E в регуляции расхождения хромосом 42
Материалы и методы.
1.Полимеразная цепная реакция и ПЦР-мутагенез 45
2. Культивирование клеточных линий HeLa, HeLa GFP Н2В 7.1 и HeLa GFP сс-тубулин...48
3. Трансформация клеток HeLa и иммуноокрашивание слайдов 48
4. Микроиньекции ДНК и цейтраферная фотосъемка 49
5. Реакция трансляции in vitro 50
6. Исследование способности связывать микротрубочки 50
7. ПААГ и иммуноблоттинг 51
8. Реакция иммунопреципитации и киназная реакция 51
9. Анализ состояния клеточного цикла 52
Результаты и обсуждение.
1. Восстановление полноразмерной копии кДНК гена CENP-E, создание кшРНК CENP-Е экспрессирующего вектора pSHAG3xFLAG и кшРНК резистентной аллели ммСЕЫР-Е126б2аа 58
2. Значение каждого из микротрубочко-связывающих доменов для функционирования CENP-Ein vivo 64
2.1 ЫН2-терминальмый микротрубочко-связывающий домен 65
2.2 СООН-термипальный микротрубочко-связывающий домен 69
2.3 Эффекты потери двух микротрубочко-связывающих доменов 72
3. Значение фосфорилирования CENP-E в процессе митоза 74
4. Оценка напряженности на кинетохорах сестринских хромосом при нарушении микротрубочкосвязывающей активности CENP-E или его регуляции 78
5. Функциональные основы взаимодействия CENP-E с киназой митотической точки рестрикции 80
Выводы 90
