Введение
2. Обзор литературы 9
2.1 Система ядерно-цитоплазматического транспорта 9
2.1.1 Компоненты ядерной оболочки 10
2.1.2 Активный ядерно-цитоплазматический транспорт 13
2.1.3 Регуляция ядерно-цитоплазматического транспорта . 19
2.1.4 Динамика ядерной оболочки в клеточном цикле 21
2.1.5 Ядерно-цитоплазматический транспорт и апоптоз 24
2.2 Ядерно-цитоплазматический транспорт при вирусных инфекциях 25
2.2.1 Преодоление барьера ядерной оболочки вирусами 25
2.2.2 Взаимодействие цитоплазматических вирусов с системой транспорта 27
2.3 Влияние пикорнавирусов на ядерно цитоплазматический транспорт 28
2.3.1 Краткая характеристика семейства Picornaviridae 28
2.3.2 Некоторые аспекты взаимодействия пикорнавирусов с клеткой 34
2.3.3 Нарушение ядерно-цитоплазматического обмена при инфекции некоторыми пикорнавирусами 37
3. Постановка задачи 1 44
4. Материалы и методы 45
4.1 Методы работы с культурами эукариотических клеток 45
4.1.1 Клеточные линии . 45
4.1.2 Культивирование клеток 45
4.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами 45
4.2.1 Плазмиды 45
4.2.2 Создание конструкции pE-luc-AL и методы молекулярного клонирования 46
4.3 Методы работы с вирусами и вирусными конструкциями 52
4.3.1 Штаммы вирусов 52
4.3.2 Размножение вирусов 53
4.3.3 Определение титра вирусной суспензии 53
4.3.4 Заражение монослоя клеток вирусами 54
4.3.5 Получение рекомбинантных вирусов 55
4.3.6 Выделение вирионной РНК 57
4.4 Экспериментальные подходы для изучения ядерно-цитоплазматического обмена и проницаемости ядерной оболочки 58
4.4.1 Изучение локализации флуоресцентных маркёров 58
4.4.2 Изучение проницаемости ЯО препарата ядер 60
4.5 Изучение фосфорилирования белков ядерной поры 64
4.6 Анализ белкового состава ядерных пор методом иммунофлуоресценции 68
4.7 Исследование ядерных пор методом электронной микроскопии 69
5. Результаты 70
5.1 Изучение влияния кардиовирусной инфекции на ядерно-цитоплазматический транспорт 70
5.1.1 Релокализация ядерных белков в цитоплазму 70
5.1.2 Причины накопления ядерных белков в цитоплазме 71
5.1.3 Релокализация цитоплазматических белков в ядро 74
5.2 Поиск вирусных продуктов, отвечающих за нарушения транспорта 75
5.2.1 Нарушение барьерных свойств ядерной оболочки, индуцированное экстрактом заражённых клеток 75
5.2.1 Роль кардиовирусных белков в нарушении транспорта 77
5.2.2 Роль доменов лидерного белка в нарушении транспорта 79
5.3 Поиск ферментативных активностей, участвующих в нарушении транспорта 83
5.3.1 Роль протеаз в нарушении транспорта 84
5.3.2 Роль протеинкиназ и фосфатаз в нарушении транспорта 85
5.4 Изучение модификаций компонентов транспортной системы 87
5.4.1 Фосфорилирование белков ядерных пор 87
5.4.2 Исследование взаимосвязи между нарушением транспорта и гиперфосфорилированием Nup62 91
5.5 Влияние кардиовирусной инфекции на состав и архитектуру ядерных пор 94
5.5.1 Анализ набора FG-содержащих нуклеопоринов в ядерных порах 94
5.5.2 Электронная микроскопия ядерных пор 96
5.6 Изучение изменения проницаемости ядерной оболочки в митозе 99
5.6.1 Анализ белкового состава ядерных пор на ранних стадиях митоза 99
5.6.2 Митотического фосфорилирование нуклеопорина Nup62 101
6. Обсуждение 104
6.1 Нарушение барьерных свойств ядерной оболочки кардиовирусами 104
6.2 Ключевая роль лидерного белка кардиовирусов в нарушении транспорта 106
6.3 Участие клеточных протеинкиназ в нарушении транспорта 108
6.4 Фосфорилирование нуклеопоринов — предполагаемый механизм нарушения барьерных свойств ядерной оболочки кардиовирусами 109
6.5 Сохранение состава и общей архитектуры ядерных пор при инфекции 114
6.6 Сходство между нарушением барьерных свойств ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции и на ранних стадиях митоза 117
6.7 Механизм изменения проницаемости ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции (гипотеза) 119
7. Выводы 121
8. Благодарности 122
9. Список литературы
