Введение
I. Мобильные генетические элементы и механизмы контроля их транспозиции (обзор литературы) 11
I.1.Классификация МГЭ. 11
I.2. Структура и механизм транспозиции ДКП ретротранспозонов . 13
I.3.Механизмы регуляции транспозиции ретроэлементов. 18
I.3.1.РНК-интерференция 19
I.3.1.1.Пути РНК-интерференции, связанные с siРНК и miРНК 19
I.3.1.2.Путь РНК-интерференции, связанный с piРНК 23
I.3.2.Регуляция посредством участия белков семейства HP1 27
II.Методы исследования 38
II.1.Материалы 38
II.1.1.Линии D. melanogaster и их характеристики 38
II.1.2.Штаммы Escherichia coli 38
II.1.3.Векторы 38
II.2.Методы 38
II.2.1. Приготовление компетентных клеток E. coli 38
II.2.2.Трансформация E. сoli 39
II.2.3.Выделение хромосомной ДНК 39
II.2.4.Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli 40
II.2.5.Сбор тканей для последующего выделения РНК 41
II.2.6.Выделение тотальной РНК 41
II.2.7.Обработка ДНКазой 42
II.2.8.Обратная транскрипция 42
II.2.9.Полимеразная цепная реакция 42
II.2.10.Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 46
II.2.11. Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов 46
II.2.12.Электрофорез в агарозном геле 47
II.2.13.Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 47
II.2.14.Секвенирование 48
II.2.15.Получение рекомбинантных белков 48
II.2.16.Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии MOPS 49
II.2.17.Окраска полиакриламидных гелей красителем Coomassie G-250 49
II.2.18.Диализ растворов белков 49
11.2.19. Измерение концентрации белка 50
11.2.20. Анализ ДКН-связывающей активности рекомбинантного белка НР1а 50
III.Результаты и обсуждение 51
III.1.Анализ транскрипции локуса flamenco 51
III.2.Молекулярно-генетический анализ сплайсинга локуса flamenco 52
III.3.Анализ экспрессии генов системы РНК-интерференции 55
III.4.Анализ роли белков семейства HP1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy 56
III.4.1.Анализ экспрессии генов семейства hp1 57
III.4.2. Связывание белка HP1a с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy 59
III.4.2.1Получение рекомбинантного белка HP1a. 59
III.4.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов группы gypsy 60
III.4.2.3 Гель-шифт анализ 63
Заключение 71
Выводы 73
Список литературы 74
