Введение
Часть I Обзор литературы 13
Глава 1 Типы клеточной смерти. Внутриклеточные посредники регуляции жизнеспособности клеток.
1.1) Некроз и апоптоз 13
1.2) Регуляция апоптоза. Семейство белков Вс1-2 17
1.3) Роль белка Р53 при апоптозе 20
1.4) Сигнальная функция внутриклеточных ионов Саг* 21
1.5) Сигнальная функция активных форм кислорода, окислительный стресс в мозге 23
1.6) Серин-треониновые протеинкиназы (MAPKs, РКА, РКВ, РКС) 3 30
Глава 2 Na/K-АТФаза и глутаматные рецепторы
2.1) Na/K-АТФаза как ионный насос и участник сигнальных каскадов 36
2.2) Рецепторы глутаматергической системы 47
2.3) Функциональная взаимосвязь между глутаматными рецепторами и Na/K-АТФазой 53
Глава 3 Биологические модели, использованные в работе
3.1) Клеточная культура нейробластомы человека SH-SY5Y 55
3.2) Линия мышей с ускоренным старением SAMP 57
Часть II Материалы и методы 60
1) Культура клеток нейробластомы человека SH-SY5y 60
2) Получение суспензии выделенных нейронов быстростареющих мышей SAMP 61
3) Определение нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) 62
4) Приготовление клеточных лизатов 66
5) Определение белка в клеточных лизатах 67
6) Разделение белков электрофорезом и Вестерн блоттинг 68
7) Определение уровня внутриклеточного кальция, активных форм кислорода
и типа клеточной смерти методом проточной цитометрии 71
8) Статистическая обработка данных 79
Часть III Результаты 80
Глава 1 Участие Na/K-АТФазы в сигнальных механизмах клеток нейробластомы человека SH-SY5Y 80
1) Определение изоформного состава Na/K-АТФазы в клетках SH-SY5Y 80
2) Уровень внутриклеточного кальция и АФК в клетках нейробластомы SH-SY5Y при действии уабаина 81
3) Активация уабаином внутриклеточных белков-посредников в клетках нейробластомы
SH-SY5Y 84
3.1) Активация уабаином р42/44 МАРК (Erkl/2) протеинкиназы 85
3.2) Активация протеинкиназы В (РКВ, Акт киназа) под действием уабаина 86
3.3) Активация уабаином про- и антиапоптозных белков 87
3.4) Определение типа клеточной смерти при действии уабаина на клеточной культуре РС-3 94
3.5) Уабаин препятствует дифференцировке клеток нейробластомы 5Н-5У5У под воздействием ретиноевой кислоты (РК) 97
Глава 2 Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках нейробластомы человека БН-5У5У 98
1) Определение субъединиц NMDA-рецепторов в клетках SH-SY5Y 98
2) Действие NMDA на уровень внутриклеточного кальция и АФК 99
3) Активация протеинкиназ р42/44 МАРК и РКВ при действии NMDA 101
Глава 3 Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии SAMP 103
Часть IV Обсуждение 107
1) Участие Na/K-АТФазы в сигнальных механизмах клеток 6Н-5У5У 107
2) Сигнальные механизмы с участием NMDA-рецепторов в клетках 5Н-5У5У 117
3) Взаимодействие ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов в нейронах мышей линии SAMP 120
Часть V Выводы 122
Часть VI Список литературы 124
Слова благодарности (Acknowledgments) 143
