Введение
ГЛАВА 1. Роль эндотелия в развитии сосудистых патологий 13
1.1. Роль эндотелия в развитии сердечно-сосудистых заболеваний 13
1.1.1. Роль воспаления в развитии атеросклероза и атеротромбоза 13
1.2. Возрастные факторы, вызывающие активацию эндотелия 17
1.3. Адгезия лейкоцитов – важный эффект активации эндотелия 20
ГЛАВА 2. Сигнальные каскады фактора некроза опухолей
2.1. Комплекс рецептора ФНО 22
2.2. Сигнальный путь NFB 24
2.3. Сигнальные пути митоген-активируемых протеинкиназ 31
2.4. Регуляция клеточной смерти фактором некроза опухоли 32
ГЛАВА 3. Митохондрии как сигнальные органеллы в клетках эндотелия 36
3.1. Продукция активных форм кислорода в митохондриях 36
3.2. Антиоксидантные механизмы митохондрий 38
3.3. Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования 40
ГЛАВА 4. Митохондриальные антиоксиданты 43
4.1. Митохондриально направленные антиоксиданты и липофильные
катионы могут выступать в роли разобщителей 45
ГЛАВА 5. Материалы, методы и объекты исследований 47
5.1. Материалы и реагенты 47
5.2. Животные
5.2.1. Выделение РНК из аорт мышей 49
5.2.2. Определение концентрации мРНК ICAM1 в аортах мышей методом микрочипа 49
5.2.3. Анализ транскрипционных путей с помощью базы данных KEGG 50
5.2.4. Обратная транскрипция 50
5.2.5. Определение концентрации мРНК ICAM1 методом ПЦР в реальном времени 51
5.2.6. Определение концентрации ФНО и IL-6 в сыворотке крови мышей методом ELISA 53
5.3. Клетки 53
5.3.1. Цитотоксический тест 54
5.3.2. Оценка количества клеток со сниженным содержанием ДНК 54
5.3.3. Анализ адгезии лимфоцитов к монослою эндотелиальных клеток. 55
5.3.4. Определение концентрации мРНК ICAM1 в клетках линии EA.hy926 55
5.3.5. Оценка экспрессии ICAM1 на поверхности клеток (In-cell Western Blot) 55
5.3.6. Определение концентрации IL-6 и IL-8 в культуральной среде 56
5.3.7. Определение относительной разности потенциалов мембран митохондрий
5.3.7. Вестерн блот 57
5.3.8. Выделение ядерной фракции для определения содержания p65 в ядре 57
5.3.9. Выделение цитоплазматической фракции для определения содержания уровня цитохрома с 5.3.10. Иммунофлуоресценция 59
5.3.11. Оценка морфологии ядер клеток 59
5.3.12. Статистическая обработка результатов 59
Результаты и обсуждение 60
Глава 6. Митохондриально-направленный антиоксидант SKQ1 подавляет активацию сосудистого эндотелия in vivo 60
6.1. Действие длительного приема SkQ1 на профиль экспрессии генов в аортах и сердцах 14-месячных мышей линии BALB/c 60
6.2. SkQ1 снижает уровень экспрессии мРНК ICAM1 у старых мышей линии C57Black/CBA. 63 6.3. SkQ1 не влияет на уровень ФНО и IL-6 в крови старых мышей
F1(CBAxC57Bl/6) и мышей линии C57BLKS-Leprdb/J с
наследственным ожирением и диабетом II типа 66
ГЛАВА 7. Характеристика клеточных линий ea.hy926 и ECV304 69
7.1. Определение фактора Виллебранда 69
7.2. Определение VE-кадгерина 71
7.8. Оценка реакции клеток линий ECV304 и EA.hy926 на фактор некроза
опухоли 74
ГЛАВА 8. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают апоптоз клеток эндотелия in vitro 77
8.1. ФНО инициирует апоптоз клеток линии EA.hy926. SkQR1 предотвращает развитие ФНО-зависимого апоптоза 77
8.2. SkQR1 подавляет митохондриальный путь индукции апоптоза 80
ГЛАВА 9. Митохондриально-направленные соединения подавляют активацию клеток эндотелия in vitro 82
9.1. Митохондриально-направленные антиоксиданты подавляют активацию эндотелия, вызванную ФНО 82
9.2. Разобщители дыхания и окислительного фосфорилирования подавляют активацию эндотелия 91
ГЛАВА 10. Механизмы защитного действия митохондриально-направленных антиоксидантов при активации эндотелия ФНО 102
10.1 В клетках линии EA.hy926 активация эндотелия регулируется преимущественно NFB- зависимым сигнальным путём 102
10.2. SkQ1 не влияет на активность MAP-киназ 102
10.3. SkQ1 снижает уровень фосфорилирования IBa 105
10.4. SkQ1 подавляет перемещение p65 в ядро 106
Заключение 113
Выводы 114
Благодарности 115
Список литературы 115
