Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Механизм действия стероидных гормонов 12
1.2. Пути развития гормональной резистентности РМЖ 20
1.2.1. Потеря рецептора эстрогена 20
1.2.2. Лиганд-независимая активация рецептора эстрогена 22
1.2.3. Митогенные сигнальные пути, поддерживающие рост РМЖ в отсутствие эстрогенов 26
1.3. Терапия эстрогензависимого и эстрогеннезависимого РМЖ 32
1.4. PAKs - важные регуляторы ключевых функций клеток 34
1.4.1. Структура семейства РАК-киназ 35
1.4.2. Механизмы регуляция РАК1 36
1.4.3. Эффекторы РАК 1 40
1.4.4. Особенности экспрессии РАК1 в опухолях молочной железы 43
1.5. Роль РАК1 в регуляции гормональной чувствительности РМЖ 45
1.5.1. Развитие гормональной резистентности РМЖ и РАК1 45
1.5.2. Рецепторные тирозинкиназы и РАК1 в регуляции гормональной чувствительности РМЖ 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
2.1. Культивирование клеток 49
2.2. Транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных плазмидных конструкций 49 2.3. Репортерный анализ 51
2.4. Получение клеточных экстрактов для SDS-электрофореза в полиакриламидном геле 52
2.5. Иммуноблоттинг 53
2.6. Определение скорости роста клеток МТТ-тестом 54
2.7. Определение метилирования гена в культуре клеток 54
2.7.1. Выделение геномной ДНК 54
2.7.2. Определение метилирования гена 55
2.8. Статистическая обработка результатов 57
2.9. Список использованных реактивов 57
2.10. Оборудование и приборы 59
ГЛАВА 3. Результаты 60
3.1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 60
3.1.1. Определение содержания РАК1 методом иммуноблотинга 60
3.1.2. Изучение зависимости экспрессии РАК1 от плотности клеточной культуры 61
3.1.3. Влияние ингибитора протеосомной деградации MG-132 на содержание РАЮ 62
3.2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 63
3.2.1. Влияние РАЮ нарост клеток 63
3.2.2. Влияние РАЮ на активность митогенных сигнальных путей 64
3.2.3. Роль а-Ріх, ко-активатора РАЮ, в регуляции активности клеточных сигнальных белков 68
3.2.4. Влияние РАЮ на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 72
3.3. РАЮ и выживаемость клеток: роль РАЮ в регуляции роста клеток в условиях гипоксии 75
3.3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF 7иНВЬ-100 75
3.3.2. Роль РАК1 в адаптации клеток MCF-7 к гипоксии 76
3.4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 80
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 86
4.1. Экспрессия РАК1 в различных линиях РМЖ 86
4.2. РАК1 в стимуляции митогенных путей в клетках РМЖ 87
4.3. РАК1 и выживаемость клеток 89
4.4. Метилирование PARI 90
Заключение 92
Выводы 94
Список использованной литературы
