ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................................ 4
Актуальность темы исследования. ............................................................................................... 4
Степень разработанности темы исследования............................................................................ 5
Цель исследования......................................................................................................................... 6
Задачи, решаемые в ходе исследования ....................................................................................... 6
Научная новизна............................................................................................................................. 6
Теоретическая и практическая значимость работы.................................................................... 7
Методология и методы исследования .......................................................................................... 8
Личный вклад автора в проведение исследования ..................................................................... 9
Степень достоверности ................................................................................................................. 9
Объем и структура диссертации................................................................................................... 9
Апробация работы ....................................................................................................................... 10
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................. 10
1.1 Наследственная природа шизофрении................................................................................. 11
1.2 Нейрохимические теории шизофрении ............................................................................... 16
1.3 Вклад эпигенетики в патогенез шизофрении ...................................................................... 20
1.3.1 3С метод ........................................................................................................................... 22
1.3.2 4С метод ........................................................................................................................... 23
1.3.3 Hi-C метод........................................................................................................................ 23
1.4 Клеточные модели шизофрении ........................................................................................... 27
1.4.1 Модели, полученные из ИПСК...................................................................................... 28
1.4.2 Нейрональные прогениторные клетки (НПК).............................................................. 29
1.4.3 Глутаматергические нейроны........................................................................................ 31
1.4.4 Дофаминергические нейроны........................................................................................ 34
1.4.5 ГАМКергические нейроны............................................................................................. 35
1.4.6 Олигодендроциты ........................................................................................................... 36
1.4.7 Нейробластома ................................................................................................................ 37
1.5 Пронейрональный транскрипционный фактор ASCL1.......................................................... 39
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ......................................................................................................... 41
2.1 Материалы .............................................................................................................................. 41
2.2 Методы.................................................................................................................................... 44
2.2.1 Метод Capture-C.............................................................................................................. 44
2.2.2 Клонирование и трансдукция лентивирусных векторов............................................. 50
2.2.3 Сборка проверочной конструкции pCheck ................................................................... 58
2.2.4 Протокол Вестерн блоттинга ......................................................................................... 60
2.2.5 Протокол ОТ-ПЦР в реальном времени........................................................................ 62
3
2.2.6 Протокол дифференцировки нейробластомы SH-SY5Y ............................................. 64
2.2.7 Проверка делеции методом ПЦР ................................................................................... 65
2.2.8 Оценка уровня CpG метилирования методом метил-чувствительной рестрикции и
ПЦР в реальном времени. ....................................................................................................... 68
2.2.9 Приготовление транскриптомной библиотеки............................................................. 69
2.2.10 Оценка уровня экспрессии генов по данным RNA-seq. ............................................ 71
2.2.11 Анализ обогащений категорий в наборе генов........................................................... 72
2.2.12 Измерение скорости деления клеточной линии......................................................... 75
3.1 Получение карты промотор-энхансерных взаимодействий в высоком разрешении
методом модифицированного Capture-C.................................................................................... 76
3.2 Получение линии SH-SY5Y с нокаутом ASCL1 .................................................................. 82
3.3 Транскриптомный анализ линий ASCL1-del и NTC........................................................... 88
3.3.1 Нокаут ASCL1 не препятствует дифференцировке клеток линии нейробластомы SHSY5Y под действитем ретиноевой кислоты .......................................................................... 88
3.3.2 Гены, ассоциированные с психическими заболеваниями перепредставлены среди
изменивших свою регуляцию на фоне нокаута ASCL1 ........................................................ 93
3.3.3 Гены нейропластичности, G2M чекпойнта и характеристичные гены
ГАМКергических нейронов репрессированы на фоне нокаута ASCL1............................... 95
3.3.4 Поиск биологических взаимодействий между генами, изменившими уровень
экспрессии на фоне нокаута ASCL1........................................................................................ 98
3.3.5 Регуляторы транскрипции REST и ASCL1 оказывают противоположное действие на
транскрипцию генов в клетках нейробластомы SH-SY5Y................................................. 100
3.3.6 На фоне нокаута ASCL1 происходит активация генов ответа на гипоксию,
регулируемая HIF-1 и подавление онкогенной активности MYC..................................... 102
3.3.6 Уровень транскрипции мРНК ASCL1 и PAH повышен при отсутствии
функционирующего белка ASCL1........................................................................................ 105
3.3.7 Уровень CpG метилирования первого экзона мРНК ASCL1 снижается на фоне
нокаута ASCL1. ....................................................................................................................... 107
3.3.8 В дифференцированной нейробластоме ASCL1 регулирует транскрипцию генов
ферментов синтеза оксида азота (II) и 17-бета-эстрадиола ............................................... 109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................................................. 111
ВЫВОДЫ........................................................................................................................................ 111
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.................................. 112
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .................................................. 113
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ.......................................... 114
