Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения о структуре и свойствах миозина 11
Мышечный миозин: история открытия и строение молекулы 11
Разнообразие миозинов. Немышечные миозины II класса 13
Атомная структура головки миозина 14
AТРазная активность миозина 16
Взаимодействие миозина с актином. Механизм мышечного сокращения 17
Легкие цепи миозина. Регуляторные легкие цепи 18
1.2. «Существенные» легкие цепи миозина (ELC) 21
Синтез, особенности первичной структуры, распространение и номенклатура изоформ ELC 21
Сердечные изоформы «существенных» легких цепей миозина 23
Влияние ELC на свойства миозина и его изолированных головок; сравнение свойств препаратов S1, содержащих разные изоформы ELC – А1 и А2 27
N-концевой сегмент «существенной» легкой цепи А1 миозина и его взаимодействие с актином 28
Взаимодействие N-концевого сегмента «существенной» легкой цепи А1 миозина с моторным доменом миозиновой головки 34
Возможные функции «существенных» легких цепей миозина в мышцах 38
Роль ELC миозина во взаимодействиях между моторным и регуляторным доменами миозиновой головки в процессе АТРазного цикла 41
1.3. Применение метода Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) для структурно-функциональных исследований головки миозина 48
2. Материалы и методы 54
2.1 Получение препаратов белков 54
Получение рекомбинантных «существенных» легких цепей (LC1 или А1) в клетках E. Coli 54
Выделение и очистка «существенных» легких цепей (LC1 или А1) 56
Разглицеринизация миозина 57
Получение S1 57
Получение актина 57
Реассоциация S1 с «существенными» легкими цепями Очистка S1, несущего рекомбинантные ELC, методом ионообменной хроматографии 58
Формирование тройных комплексов S1 с АDР и аналогами Pi. 58
2.2. Методы модификации различных белков 59
Модификация SH1-группы остатка Cys707 в S1 и единственного остатка Cys изолированных ЕСL флуоресцентным красителем 59
Модификация актина флуоресцентной меткой 60
2.3 Флуоресцентные методы анализа исследуемых препаратов 60
Исследование температурных зависимостей флуоресценции S1 60
Исследование температурных зависимостей флуоресценции и светорассеяния S1 в комплексе с B-кристаллином 61
Ферстеровский резонансный перенос энергии (FRET) 61
2.4 Температурные методы исследования структуры S1 62
Исследование тепловой денатурации S1 методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) 62
Динамическое светорассеяние (DLS) 63
Тепловая агрегация S1(A1) и S1(A2) 63
2.5 Другие аналитические методы исследования белков 64
Определение концентрации белка 64
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS 64
Определение АТРазной активности S1 65
3. Результаты и их обсуждение 66
3.1. Роль C-конецевой части ELC, ассоциированной с регуляторным доменом миозиновой головки, во взаимодействии между моторным и регуляторным доменами головки в процессе АТРазного цикла 66
Тепловая денатурация S1 в составе тройных комплексов S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx 66
Сравнение свойств рекомбинантных ELC дикого типа со свойствами ELC, выделенных из миозина скелетных мышц кролика 70
Температурные изменения флуоресценции меченых рекомбинантных ELC, связанных с регуляторным доменом S1 в отсутствие нуклеотидов 71
Температурные зависимости флуоресценции и светорассеяния S1
в присутствии малого белка теплового шока HspB5 74
Температурные зависимости флуоресценции меченых ELC, связанных с регуляторным доменом S1, в тройных комплексах S1-ADP-BeFx и S1-ADP-AlF4- 75
Тепловая диссоциация ELC от тяжелой цепи S1 79
Измерение дистанций между С-концевой частью ELC и активным центром S1 с помощью метода FRET 84
3.2. Особенности функционирования N-концевого сегмента А1 87
Взаимодействие N-концевого сегмента А1 с актином 87
Необычные агрегационные свойства препарата S1(А1) 91
Исследования препаратов S1(А1) и S1(А2) методом динамического светорассеяния 94
Измерение расстояний между N-концевым сегментом A1 и моторным доменом S1 методом FRET 100
Предполагаемые межмолекулярные и внутримолекулярные взаимодействия N-концевого сегмента А1 в процессе АТРазного цикла миозиновой головки 103
Заключение 106
Список используемой литературы 108
