Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1.Амилоиды 11
1.2. Прионы. Прионные болезни 13
1.3. Прионы дрожжей 15
1.3.1 Прионы [PSI+] и [PIN+] 20
1.4. Штаммовое разнообразие прионов 23
1.5. Фрагментация дрожжевых прионов 25
1.6. Амилоидозы 29
1.6.1. Нейродегенеративные локализованные амилоидозы не полиглутаминовой природы 29
1.6.2. Полиглутаминовые заболевания 32
1.7. Дрожжевая модель болезни Гентингтона 34
1.8. Взаимодействия между глутамин-богатыми белками. Кросс-сидинг 35
1.9. Детоксификация полимеров полиглутаминовых белков в результате белок-белковых взаимодействий 39
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Культивирование клеток S. cerevisiae 42
2.2. Культивирование клеток E. coli 42
2.3. Выделение ДНК из E. coli 43
2.4. Выделение ДНК из дрожжей S. cerevisiae 43
2.5. Штаммы S. Cerevisiae 44
2.6. Трансформация плазмид в S. cerevisiae и E. coli 44
2.7. Конструирование плазмид и молекулярное клонирование 46
2.8. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов 52
2.9. Исследование количеств растворимых форм белков при помощи ультрацентрифугирования 52
2.10. Белковый гель-электрофорез, иммуноблотинг 52
2.11. Спот тест для оценки жизнеспособности клеток дрожжей продуцирующих рекомбинантные белки 54
2.12. Измерение уровня интенсивности флуоресценции 54
Глава 3. Результаты 56
3.1. Продукция некоторых искусственных глутамин-богатых белков вместе с белком Htt25Q-GFP токсична для клеток дрожжей S. сerevisiae 56
3.2. Токсичность полимерной формы нормального гентенгтина Htt25Q-GFP не всегда зависит от наличия амилоидов Rnq1 66
3.3. Делеция гена HSP104 в штамме 74D-694 снимает токсический эффект, связанный с совместной продукцией белка Htt25Q-GFP с искусственными полиQ-белками 69
3.4. Сравнение размеров полимеров полиQ/QX белков, нормального гентингтина Htt25Q-GFP и белка Sup35 73
3.5. Белок 25Q-RFP может переходить в агрегированное состояние и вызывать токсичность в присутствии амилоидов белка 120QY-HA 75
3.6. Агрегаты Htt25Q-RFP обнаруживаются с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии (работа выполнена совместно с Ю.Н. Антоненко) 76
3.7. Токсичность Htt25Q связана с истощением растворимых форм белков Sup35 и Sup45 79
3.8. Сверхпродукция прионного белка Rnq1 приводит к агрегации и токсичности белка Htt25Q-GFP в клетках с фенотипом [PIN+] 86
3.9. Растворимый Htt25Q-GFP может проявлять токсичность в неоптимальных для роста условиях 90
3.10. Полимеры мутантного и нормального гентингтина по-разному индуцируют полимеризацию глутамин богатых белков 96
Механизмы токсичности гентингтина отличаются для разных штаммов 100
3.11. Делеция DEF1 в штамме BY4742 уменьшает количество детергент-устойчивых агрегатов Htt103Q и снимает токсичность, при этом не оказывая влияния на количество полимеризованного белка Sup35 100
3.12. Делеция DEF1 в штамме 74-D694 уменьшает количество детергент-устойчивых агрегатов белков Htt103Q и Sup35, но не приводит к снятию токсического эффекта 105
3.13. Истощение растворимой формы белков Sup35 и Sup45 не является причиной токсичности мутантного гентингтина у штамма BY4742 107
Глава 4. Обсуждение 109
4.1. Белок Htt25Q-GFP может агрегировать и приводить к замедлению роста клеток дрожжей в присутствии амилоидов других белков 109
4.2. Эффект посредника в амилоидной кополимеризации и полимеризационные каскады 111
4.3. Молекулярные основы токсичности белка Htt25Q-GFP 114
4.4. Роль немутантных аллелей в патогенезе полиглутаминовых заболеваний. Взаимодействие между амилоидозами 115
4.5. Причины токсичности мутантного гентингтина различаются для разных штаммов дрожжей 119
Заключение 122
Благодарности 123
Список литературы 124
