СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………………..……6
ВВЕДЕНИЕ..…………………………………………………………………………...………7
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности…..………………7
Цели и задачи исследования…..………………………………………………….………7
Научная новизна исследования….………………………………………………..……..8
Теоретическая и практическая значимость исследования….………………….…....8
Методология и методы исследования….……………………………………….….…....9
Положения, выносимые на защиту….…………………………………………………..9
Степень достоверности и апробация результатов….………………………………...10
Личный вклад автора….……………………………………………………..…………..12
Структура и объем работы….……………………………………………….…………..13
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………….……...14
1.1 Роль ядерной ламины в организации хроматина в ядре……………………..….14
1.1.1 Строение ядерной оболочки.……………………………………………..………14
1.1.2 Неслучайное положение хромосом в ядре………………………………….........15
1.1.3 Свойства периферического гетерохроматина……………………………..…..16
1.1.4 Соответствие между ЛАДами и другими типами доменов в геномах
эукариот………………………………………………………………………………….20
1.1.5 Репрессия ядерной ламиной транскрипции генов в ЛАДах………………..........22
1.1.6 Факторы, вызывающие репрессию генов в ЛАДах……………………………...24
1.1.7 Связь между транскрипцией генов и их локализацией в ядре………………….25
1.1.8 Белки, связывающие ЛАДы с ядерной ламиной…………………………….........27
1.1.9 Механизмы перемещения хроматина в ядре…………………………………….29
1.1.10 Влияние связи периферического гетерохроматина с ядерной оболочкой
на геномную архитектуру в норме и при патологиях…………………………….......30
1.2 Роль Elys и других нуклеопоринов в организации хроматина в ядре……….....33
1.2.1 Роль Elys в постмитотической сборке комплексов ядерных пор и других компонентов ядерной оболочки…………………………………………………………34
1.2.2 Взаимодействия Elys и других нуклеопоринов с геномом дрозофилы……….....36
1.2.3 Влияние Elys и других нуклеопоринов на экспрессию генов…………..…............39
1.2.4 Заключение…………………………………………………………………….........42
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ.………………………………………………………………………….43
2.1 Конструирование плазмид……………………………………………………………43
2.2 Работа с дрозофилой…………………………………………………………………...44
2.3 DamID-seq……………………………………………………………………………….45
2.4 Работа с культурами клеток и РНК-интерференция……………………………....46
2.5 Вестерн-блот анализ…………………………………………………………………...47
2.6 Иммуноокрашивание клеток………………………………………………………...47
2.7 Иммуноокрашивание органов……………………………………………………….48
2.8 Иммуноокрашивание политенных хромосом……………………………………...49
2.9 Иммуноокрашивание хроматина антителами к гистону H4 или к H3K27Ac....49
2.10 Окрашивание семенников на X-gal………………………………………………...50
2.11 TUNEL анализ………………………………………………………………………...50
2.12 FISH с ДНК зондами с последующим иммуноокрашиванием………………….50
2.13 FISH с олиго(dT) зондом…………………………………………………………......51
2.14 РНК in situ гибридизация…………………………………………………………....52
2.15 Чувствительность хроматина к ДНКазе I………………………………………...52
2.16 Иммунопреципитация хроматина (ChIP-seq)…………………………………….53
2.17 Коиммунопреципитация белков…………………………………………………...54
2.18 Нозерн-блот анализ...………………………………………………………………...54
2.19 RNA-seq………………………………………………………………………………...55
2.20 Биоинформатический анализ данных……………………………………………..55
2.20.1 Биоинформатический анализ данных DamID-seq……………………………....55
2.20.2 Биоинформатический анализ данных ChIP-seq………………………………...56
2.20.3 Биоинформационный анализ данных RNA-seq………………………………….56
2.20.4 Биоинформатический анализ данных из внешних источников………………..57
2.20.5 Измерение расстояний между сигналами FISH и ядерной оболочкой
в клетках S2…………………………………………………………………………........57
2.20.6 Измерение расстояний между центромерами и ядерной оболочкой
в нейронах и клетках Kc167……………………………………………………………..58
2.20.7 Анализ распределения хроматина в ядре………………………………………..58
2.20.8 Создание списков повсеместно и тканеспецифично экспрессирующихся
генов………………………………………………………………………………….........58
2.20.9 Анализ распределения МЭ в геноме……………………………………………...60
2.20.10 Создание усредненных профилей……………………………………………….60
2.20.11 Получение профилей экспрессии генов с помощью EST………………………60
2.20.12 Анализ мотивов в последовательности ДНК…………………………………60
2.20.13 Статистический анализ……………………………………………………......61
2.20.14 Депонирование данных…..……………………………………………………...61
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………………….62
3.1 Обнаружение кластеров семенник-специфичных генов в геноме дрозофилы..62
3.2 Анализ структуры хроматина в кластере семенник-специфичных генов из
района 60D………………………………...………………………………………………..66
3.2.1 Анализ транскрипции генов из района 60D……………………………………...66
3.2.2 Семенник-специфичные гены кластера из района 60D располагаются в двух соседних доменах устойчивого к ДНКазе I хроматина в соматических клетках дрозофилы…………………………………………………………………….....……….69
3.3 Семенник-специфичные гены в соматических клетках репрессированы
контактами с ядерной ламиной ………………………………..………………………..72
3.3.1 Кластеры семенник-специфичных генов в соматических клетках
дрозофилы связаны с ядерной ламиной…………………………………………………72
3.3.2 Ламин Dm0 необходим для поддержания репрессированного состояния
кластеров семенник-специфичных генов в соматических клетках дрозофилы……..74
3.3.3 Активация транскрипции кластеров семенник-специфичных генов
сопровождается их удалением от ядерной оболочки…………………………………75
3.4 Гистондеацетилаза HDAC3 является одним из факторов, определяющих
периферическую локализацию кластера семенник-специфичных генов из
района 60D в соматических клетках дрозофилы……………………………..…….78
3.5 Анализ периферического гетерохроматина в нейронах дрозофилы..…………..80
3.5.1 DamID-картирование ЛАДов и участков обогащения HP1a и Pc в
нейронах дрозофилы……………………………………………………………………..80
3.5.2 В нейронах, в отличие от эмбриональных клеток Kc167, ЛАДы
значительно обогащены HP1a………………………………………………………….82
3.5.3 Гены, находящиеся в ЛАДах, доменах HP1a или Pc, экспрессируются
на очень низком уровне…………………………………………………………………..84
3.5.4 Подавляющее большинство промоторов повсеместно экспрессирующихся
и активных тканеспецифичных генов не связаны с ядерной ламиной …………........85
3.5.5 Центромеры в нейронах расположены ближе к ядерной оболочке, чем в
клетках Kc167……………………………………………………………………………87
3.5.6 «Созревание» периферического гетерохроматина в терминально дифференцированных нейронах дрозофилы……………………………………………88
3.6 Анализ геномной архитектуры на двух последовательных стадиях
дифференцировки герминальных клеток самцов дрозофилы………………………91
3.6.1 Картирование ЛАДов в сперматогониях и сперматоцитах дрозофилы……..91
3.6.2 Aly-независимые СпЦ-специфичные гены утрачивают связь с ядерной
ламиной при их активации в СпЦ………………………………………………….......94
3.6.3 В СпГ и СпЦ Х-хромосома сильнее связана с ядерной ламиной,
по сравнению с аутосомами………………………………………………………........97
3.6.4 В СпГ действует механизм неканонической дозовой компенсации……….......98
3.6.5 Разрушение ядерной ламины приводит к ослаблению экспрессии
СпЦ-специфичных генов в СпЦ………………………………………………………..101
3.7 Целостность ядерной ламины необходима для корректной
пространственной организации хроматина в ядре …………………………………104
3.7.1 Lam-KD в клетках S2 приводит к уменьшению объема хроматина в ядре
и его удалению от ядерной оболочки…………………….…………………………...104
3.7.2 Плотность хроматина в ЛАДах снижается при утрате их связи с ядерной
ламиной…………………………………………………………………………………107
3.7.3 Разрушение ядерной ламины вызывает усиление «фоновой»
транскрипции в ЛАДах…………………………………………………………….......108
3.8 Нуклеопорин Elys, находясь в составе комплексов ядерных пор, удерживает
периферический гетерохроматин около ядерной оболочки…………..……………112
3.8.1 Нокдаун Elys в клетках S2 дрозофилы не приводит к значительной
потере ядерных пор на ядерной оболочке……………………………………….........113
3.8.2 Elys связывается с многочисленными сайтами на политенных
хромосомах……………………………………………………………………………...117
3.8.3 Идентификация сайтов связывания Elys в поздних эмбрионах………………118
3.8.4 Elys в составе комплексов ядерных пор связывается с многочисленными
геномными сайтами, расположенными внутри ЛАДов……………………………..120
3.8.5 Elys дрозофилы распознает A/T-богатые мотивы в ДНК…………………….125
3.8.6 Связывание периферического гетерохроматина с Elys, находящимся
в составе комплексов ядерных пор, удерживает хроматин около ядерной оболочки…………………………………………………………………………………127
3.8.7 Elys обогащен на 5’- и 3’-концах генов…………………………………….........130
3.8.8 Elys-KD в клетках S2 вызывает дерепрессию генов в ЛАДах…………………132
ЗАКЛЮЧЕНИЕ...……………………………………………………………………………136
ВЫВОДЫ.…..…………………………………………………………………………….......144
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.…..……………………………………………………………..145
БЛАГОДАРНОСТИ....………………………………………………………………………173
