Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Эмбриональные стволовые клетки как связующее звено исследований проблем эмбриональной диффереицировки в системах in vitro и in vivo , 12
1.1.1. Общая характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения 12
1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки 14
1.1.3. Культивирование эмбриональных стволовых клеток 14
1.1.4. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток in vitro 15
1.1.5. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток in vivo 16
1.2. Применение эмбриональных стволовых клеток 16
1.3. Гибридные клетки между стволовыми и дифференцированными клетками как модель для изучения процессов репрограммирования 17
1.4. Сегрегация хромосом в гибридных клетках 20
1.5. Использование микросателлитов в качестве генетических маркеров 25
1.6. Роль митохондрий в нормальном развитии, экспериментально реконструированных зиготах и гибридных клетках 27
1.6.1. Организация митохондрий млекопитающих 27
1.6.2. Сегрегация мтДНК у клонированных млекопитающих, полученных методом трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты 28
1.6.3. Сегрегация мтДНК при гетероплазмии 29
1.6.4. Сегрегация мтДНК в гибридных клетках 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Клетки и клеточные линии 35
2.2. Работа с культурами клеток 36
2.2.1. Пассирование клеток 36
2.2.2. Субклонироваиие 37
2.2.3. Замораживание клеток 37
2.2.4. Размораживание клеток 38
2.3. Выделение геномной ДНК 38
2.4. ПЦР-анализ микросателлитов 39
2.4.1. Условия ПЦР для амплификации микросателлитов 39
2.4.2. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР 39
2.5. Анализ мтДНК 40
2.5.1. ПЦР фрагментов мтДНК 40
2.5.2. Выделение амплифицированного фрагмента ДНК 42
2.5.3. Подготовка фрагмента мтДНК для секвенирования 43
2.5.4. Секвенирование мтДНК 43
2.6. Рестрикционный анализ мтДНК 43
2.7. ПЦР-анализ мтДНК единичных клеток 44
2.8. Цитогенетический анализ 45
2.8.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом 45
2.8.2, Подсчет хромосом 46
ГЛАВА 3. Результаты 47
3.1. Идентификация родительских хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит и ЭС-фибробласт с помощью полиморфных микросателлитов 47
3.1.1. Выбор микросателлитиых маркеров, дискриминирующих гомологичные хромосомы мышей линий 129/Ola, DD/c и мышей М. caroli 47
3.1.2. Оптимизация условий ПЦР для алельных вариантов микросателлитов у мышей линий 129/01anDD/c 50
3.1.3. Оптимизация условий ПЦР для анализа аллельных вариантов микросателлитов мышей М. musculus иМ. caroli 53
3.2. Сегрегация хромосом в клонах внутривидовых гибридных клеток 56
3.3. Сегрегация хромосом в клонах межвидовых гибридных клеток 64
3.4. Сегрегация митохондрий в клонах внутривидовых гибридных клеток 69
3.5. Сегрегация митохондрий в клонах межвидовых гибридных клеток 74
ГЛАВА 4. Обсуждение 77
Выводы 89
Список литературы
