Введение
1. Введение 12
1.1. Актуальность темы. Основные современные представления о холинергической регуляции миокарда 12
1.2. Задачи исследования 15
1.3. Научная новизна исследования 16
1.4. Научно-практическая значимость 17
1.5. Основные положения, выносимые на защиту 18
2. Обзор литературы 21
2.1. Парасимпатическая иннервация сердца 21
2.1.2. Внутрисердечное нервное сплетение 24
2.1.3. Структура вегетативных синапсов в сердечной ткани 30
2.2. Жизненный цикл АХ 33
2.2.1. Синтез АХ в нейронах 33
2.2.2. Синтез АХ в мышечных клетках 35
2.2.3. Квантовая секреция АХ 36
2.2.4. Распад АХ. Ацетилхолинэстераза 39
2.2.5. Обратный захват холина. Система захвата холина высокого сродства 41
2.3. Неквантовая секреция АХ 43
2.3.1. Открытие неквантовой секреции АХ 43
2.3.2. Механизм неквантового выделения АХ 44
2.3.3. Неквантовая секреция АХ в нейронах, иннервирующих гладкие мышцы дыхательных путей 46
2.3.4. Неквантовая секреция АХ в сенсорных нейронах позвоночных и беспозвоночных 47
2.3.5. Регуляция неквантовой секреции АХ 48
2.3.6. Гипотезы о физиологической роли феномена неквантовой секреции АХ 54
2.4. Реализация холинергических эффектов в сердце 55
2.4.1. Общая характеристика мускариновых рецепторов 56
2.4.2. Мускариновые рецепторы в сердце 58
2.4.3. М2-рецепторы в сердце 60
2.4.4. М3-рецепторы в сердце млекопитающих 65
2.5. Особенности холинергичекой стимуляции при возникновении патологических состояний в сердце 72
2.5.1. Ишемическое повреждение миокарда и М3-рецепторы 73
2.5.2. Патологическая гипертрофия сердца и М3-рецепторы 74
2.5.3. Аритмия и мускариновые рецепторы 75
2.5.4. Сердечная недостаточность и М3-рецепторы 2.6. Особенности холинергической регуляции миокарда у низших позвоночных 77
2.7. Развитие холинегической регуляции в ходе онтогенеза 82
3. Методика 86
3.1. Животные 87
3.1.1. Взрослые млекопитающие 87
3.1.2. Получение крысят и 19-дневных крысиных эмбрионов 87
3.1.3. Хроническая десимпатизация крыс 88
3.1.4. Рыбы и амфибии 88
3.2. Внутриклеточная регистрация электрической активности 89
3.2.1. Получение препаратов миокарда млекопитающих 89
3.2.2. Внутриклеточная регистрация ПД 91
3.2.3. Ход эксперимента 92
3.2.4. Обработка препаратов миокарда ботулиническим токсином 93
3.2.5. Обработка результатов 93
3.3. Метод пэтч-кламп 94
3.3.1. Выделение изолированных кардиомиоцитов крысы 94
3.3.2. Регистрация кальциевого тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах методом пэтч-кламп 95
3.3.3. Регистрация калиевых токов в изолированных кардиомиоцитах методом пэтч-кламп 96
3.3.4. Обработка результатов
3.4. Оценка динамики эндоцитоза и экзоцитоза в предсердных препаратах с помощью флуоресцентной метки FM1-43 97
3.5. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда
3.5.1. Использованные антитела 99
3.5.2. Протокол окраски
3.6. Определение общего количества мускариновых рецепторов с помощью специфических антител 100
3.7. Молекулярно-биологические исследования уровня экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
3.7.1. Выделение тотальной РНК из препаратов сердечной мышцы 101
3.7.2. Обработка ДНКазой I 102
3.7.3. Обратная транскрипция 103
3.7.4. Выделение геномной ДНК 104
3.7.5. Праймеры, использованные в работе 105
3.7.6. Полимеразная цепная реакция 106
3.8. Использованные в работе физиологически активные вещества 107
4. Результаты 109
4.1. Неквантовый способ секреции АХ в миокарде, выяснение его механизма и способов регуляции. 110
4.1.1. Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде млекопитающих 110
4.1.2. Свидетельства широкого распространения феномена неквантовой секреции АХ в миокарде среди позвоночных животных. 134
4.1.3. Выяснение механизма неквантовой секреции в миокарде на примере предсердного миокарда крысы 141
4.1.4. Регуляция неквантовой секреции АХ различными кардиотропными сигнальными соединениями 151
4.2. Исследование рецепторных механизмов холинергической регуляции сердца 163
4.2.1. Молекулярно-биологические доказательства наличия М3-рецепторов в миокарде млекопитающих 163
4.2.2. Электрофизиологические эффекты стимуляции М3-холинорецепторов в миокарде млекопитающих 169
4.2.3. Молекулярные механизмы электрофизиологических эффектов стимуляции М3-рецепторов 177
4.3. Изучение особенностей механизмов холинергической регуляции миокарда на ранних стадиях онтогенеза. 187
4.3.1. Особенности электрической активности предсердного и желудочкового миокарда крыс на ранних стадиях онтогенеза. 188
4.3.2. Доказательство наличия неквантовой секреции АХ в миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза. 192
4.3.3. Выявление уровня экспрессии генов М2 и М3-холинорецепторов в желудочковом и предсердном миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза. 196
4.3.4. Исследование электрофизиологических эффектов стимуляции М2 и М3-холинорецепторов в желудочковом и предсердном миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза. 198
5. Обсуждение результатов 203
5.1. Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде 203
5.2. Механизм неквантовой секреции АХ 206
5.3. Регуляция неквантовой секреции АХ в миокарде 207
5.4. Наличие функционально активных М3-холинорецепторов в миокарде крысы и мыши 209
5.5. Новый молекулярный механизм электрофизиологических эффектов стимуляции М3-рецепторов 210
5.6. Становление холинергической регуляции миокарда в процессе онтогенеза 212
5.7. Ограничения и возможные недостатки проведенного исследования 214
5.8. Перспективы дальнейших исследований 216
6. Выводы 219
7. Список литературы 220
8. Благодарности
