1. Список сокращений. ...............................................................................................................5
2. Введение...................................................................................................................................6
3. Актуальность темы исследования. ........................................................................................9
4. Научная новизна и практическая значимость работы. ......................................................10
5. Цель и задачи исследования.................................................................................................11
6. Обзор литературы. ................................................................................................................12
6.1. Появление экспериментальной эмбриологии. Открытие феномена эмбриональной
регуляции. ..............................................................................................................................................12
6.2. Регуляционный и мозаичный тип развития животных......................................................16
6.3. Открытие эмбриональных индукций. Опыты Хёрстадиуса и Шпемана. ........................24
6.3.1. Опыты Хёрстадиуса: эмбрион как саморегулирующаяся система дальнодействующих
сигналов. ................................................................................................................................................24
6.3.2. Опыты Шпемана и Мангольд. Эмбриональный организатор как источник
дальнодействующих саморегулирующихся сигналов.......................................................................25
6.3.3. Распространенность шпемановских индукций среди вторичноротых. ...........................29
6.3.4. Аналогичные шпемановскому организатору структуры у первичноротых. ...................31
6.4. Механизмы формирования дорзо-вентральной оси...........................................................33
6.4.1. Первичная эмбриональная индукция. Открытие ньюкуповского центра........................33
6.4.2. Молекулярный механизм формирования шпемановского организатора.
Взаимодействие ньюкуповского центра и BCNE-центра. ................................................................36
6.4.3. Механизмы дорзо-вентральной разметки...........................................................................38
6.4.3.1. Открытие молекулярных основ шпемановской индукции................................................38
6.4.3.2. Молекулярный механизм ВМР-каскада..............................................................................42
6.4.3.3. Роль ВМР-каскада в дорзо-вентральной разметке среди эуметазой................................44
6.5. Молекулярные механизмы эмбрионального скейлинга. ...................................................58
6.5.1. Модели паттернинга. Градиентная модель Вольперта и Крика. Реакционнодиффузионная модель Тьюринга.........................................................................................................58
6.5.2. Модели эмбрионального скейлинга. ...................................................................................59
6.5.2.1. Скейлинг в градиентной модели Вольперта-Крика...........................................................593
6.5.2.2. Скейлинг в модели синтеза-диффузии-деградации...........................................................60
6.5.2.3. Скейлинг с помощью размер-зависимого модулятора. Пассивная модуляция...............62
6.5.2.4. Активная модуляция. Модели «экспандер-репрессор» и «индуктор-контрактор». .......65
6.5.2.5. Модели скейлинга дорзо-вентральной оси.........................................................................68
6.5.2.6. Поиск новых модуляторов. Скейлеры.................................................................................69
7. Результаты. ............................................................................................................................72
7.1. Все известные модели скейлинга, основанные на модуляции морфогенетического
градиента, имеют элементы со значительной разницей в концентрации........................................72
7.2. Поиск новых скейлеров с помощью сравнения транскриптомов интактных и
уменьшенных зародышей шпорцевой лягушки. ................................................................................72
7.3. Исследование экспрессии гена матриксной металлопротеиназы-3 в раннем развитии
шпорцевой лягушки. .............................................................................................................................76
7.4. Нокдаун mmp3 приводит к уменьшению сомитной мезодермы и нервной пластинки, но
одновременно к увеличению нотохорда. ............................................................................................77
7.5. Mmp3 расщепляет секретируемые белки Noggin1 и 2 и препятствует деградации Chordin
путем разрушения металлопротеиназы Tolloid-like1.........................................................................82
7.6. В соответствии с ролью Mmp3 как экспандера для Chordin, подавление функции Mmp3
вызывает расширение вентрального маркера sizzled.........................................................................87
7.7. Подавление Chordin вызывает сужение (скейлинг) сомитов и нервной пластинки, а
активация Noggin1/2 вызывает расширение (антискейлинг) нотохорда. ........................................88
7.8. Моделирование Mmp3-опосредованного скейлинга. .................................................................92
8. Обсуждение............................................................................................................................99
9. Выводы.................................................................................................................................102
10. Материалы и методы...........................................................................................................103
10.1. Материалы. ..........................................................................................................................103
10.1.1. Среды и растворы................................................................................................................103
10.1.2. Антитела, коммерческие наборы и реактивы, бактериальные штаммы. .......................107
10.1.3. Олигонуклеотиды морфолино. ..........................................................................................111
10.1.4. Модельные объекты и программное обеспечение. ..........................................................112
10.1.5. Оборудование. .....................................................................................................................1134
10.2. Методы. ................................................................................................................................115
10.2.1. Манипуляции с эмбрионами шпорцевой лягушки. .........................................................115
10.2.2. Выделение тотальной РНК из эмбрионов.........................................................................116
10.2.3. Высокопроизводительное секвенирование.......................................................................117
10.2.4. Создание генетических конструкций. ...............................................................................117
10.2.5. Синтез РНК in vitro. ............................................................................................................121
10.2.6. Получение антител..............................................................................................................122
10.2.7. Белковый электрофорез и вестерн-блоттинг. ...................................................................122
10.2.8. Гибридизация in situ............................................................................................................123
10.2.9. Иммуногистохимия.............................................................................................................124
10.2.10. Количественная ОТ-ПЦР....................................................................................................124
10.2.11. CRISPR/Cas9-нокаут. ..........................................................................................................126
10.2.12. Статистический анализ данных. ........................................................................................126
10.2.13. Математическое моделирование и скрининг in silico......................................................126
11. Список литературы. ............................................................................................................127
