Введение
I. Обзор литературы II
I. Природа, возникновение дополнительных оснований и содержание 5-метилцнтозина в ДНК растений II
1.1. Природа дополнительных оснований в ДНК растений ... II
1.2. Содержанке 5-метилцитозина в ДНК растений -12
1.2.1. Видовые различия 12
1.2.2. Тканевая (клеточная) разнокачественность метилирования генома растений 13
1.2.3. Метилированные основания в ДНК субклеточных органелл растений (хлоропласти и митохондрии) 14
1.2.4. Метилирование ДНК при разных инфекциях и неблагоприятных условиях произрастания 15
1.2.5. Метилирование ДНК при прорастании семян 17
1.3. Возникновение дополнительных метилированных оснований в ДНК растений 19
1.3.1. Механизм метилирования 19
1.3.2. Специфичность метилирования ДНК 22
1.4. Распределение 5-метилцитозина в геноме 24
1.4.1. Метилирование сателлитной ДНК 24
1.4.2. Содержание 5-метилцитозина в AT- и GC -обогащенных фракциях ДНК 24
1.4.3. Метилирование повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК 25
1.5. Метилирование и синтез ДНК 26
1.5.1. Возникновение полупрометилированных сайтов .... 28
1.5.2. Влияние 5-азацитидина 30
Стр. 1.6. Возможная функциональная роль метилирования ДНК у эукариотов 30
II. Экспериментальная часть 37
2. Материалы и методы исследования . 37
2.1. Обработка и посев семян пшеницы, отбор и пикировка проростков . . 37
2.2. Введение радиоактивной метки в ДНК проростков ... 37
2.2.1. Срезанные проростки 37
2.2.2. Целые проростки 38
2.3. Фиксация проростков и подготовка к выделению ДНК . . 38
2.4. Выделение ДНК 38
2.4.1. Использование модифицированного метода Шмидта и Таннгаузера для определения уровня метилирования и состава новообразованной ДНК 38
2.4.2. Выделение ДНК с проназной и РЖазной обработкой для фракционирования в градиенте плотности хлористого цезия 39
2.4.3. Выделение ДНК с проназной и щелочной обработкой
для анализа уровня метилирования 40
2.5. фракционирование ДНК в градиенте плотности хлористого цезия 40
2.6. Анализ состава и уровня метилирования ДНК 41
2.6.1. Суммарная немеченая ДНК 41
2.6.2. Меченая новообразованная ДНК 43
2.7. Анализ состава (плавучей плотности) ДНК методом равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия . 44
2.8. Выделение и очистка митохондрий из проростков пшеницы 45
2.9. Фиксация митохондрий, обработка, подготовка препаратов, электронная микроскопия 46
2.10. Выделение ДНК из градиента плотности хлористого
цезия и измерение радиоактивности 47
2.11. Измерение радиоактивности, включенной в ДНК от
дельных органов проростка (динамика синтеза ДНК
в проростке) 48
2.12. Определение содержания ДНК в проростке 49
3. Результаты и их обсуждение 51
3.1. Состав и уровень метилирования новообразованной ДНК в развивающихся проростках пшеницы 51
3.1.1. Проростки пшеницы разного возраста 51
3.1.2. Разные органы проростков пшеницы 53
3.1.3. Колеоптили и листья разного возраста 54
3.2. Митохондриальная природа фракции ДНК, синтезирующейся в стареющих колеоптилях: ее состав и уровень метилирования 55
3.2.1. Метаболическая стабильность новообразованной в стареющем колептиле ДНК 55
3.2.2. Влияние циклогксимида и бромистого этидия на синтез ДНК в стареющих колеоптилях 59
3.2.3. Влияние истощения путем инкубации в воде срезанных проростков на синтез ДНК 60
3.2.4. Митохондриальная природа новообразованной в стареющих колеоптидях ДНК, ее состав и уровень метилирования 64
3.3. Первый лист развивающихся этиолированных проростков пшеницы как модель для исследования метилирования ДНК в клеточном цикле на уровне целого растения: синхронность синтеза ДНК в органе и возможность дифференцировать синтез мтДНК и яДНК 71
3.4. Метилирование яДНК в клеточном цикле интеркалярной меристемы первого листа развивающихся проростков пшеницы 84
3.4.1. Уровень метилирования ДНК, синтезируемой в разные моменты цикла синтеза (короткая импульсная метка) 84
3.4.2. Динамика "дометилирования" новообразованной ДНК
вне репликации 87
3.4.3. Исследование репаративного синтеза ДНК в клеточном
цикле в развивающихся проростках пшеницы 89
Заключение 92
Выводы 94
Литература 95
