Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Запасные вещества у животных — жир и гликоген. Различная стратегия использования жиров и углеводов в организме 14
1.2. Содержание гликогена в различных тканях, клетках. Динамика в процессе жизнедеятельности. Пищевой цикл. Накопление гликогена в различных тканях перед рождением животного. Значение запасов гликогена для мышечного сокращения 15
1.3. Локализация гликогена в гепатоцитах. Первичная структура гликогена, центральная роль печени в его метаболизме. Синтез и деградация гликогена в печени. Ферменты метаболизма гликогена 21
1.4. Тканевые и клеточные факторы, влияющие на метаболизм и содержание гликогена 34
1.5. Нарушения метаболизма гликогена в печени 40
1.6. Структура молекулы гликогена. и -частицы гликогена 48
1.7. Фракции гликогена, извлекаемые при обработке тканей трихлоруксусной кислотой и КОН. Про- и макрогликоген 57
1.8. Основные принципы метода FRET 64
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 67
2.1. Объекты исследования 67
2.1.1. Экспериментальные животные 67
2.1.2. Клинический материал 67
2.2. Методы приготовления препаратов 68
2.2.1. Приготовление и окрашивание парафиновых срезов 68
2.2.2. Приготовление препаратов-мазков изолированных клеток печени 68
2.3. Комбинированный цитохимический метод для количественного определения нескольких компонентов в одной и той же клетке 69
2.3.1. Определение сухой массы гепатоцитов 70
2.3.2. Выявление и измерение содержания общего гликогена в изолированных гепатоцитах крысы 71
2.3.3. Определение содержания ДНК в ядрах гепатоцитов крысы и человека 72
2.4. Разработка метода для исследования структуры гликогена в отдельных клетках 73
2.4.1. Выбор пары красителей, пригодных для FRET-анализа 73
2.4.2. Определение кинетики окрашивания гликогена в гепатоцитах с помощью реактивов типа Шиффа Au-SO2 и EtBr-SO2 75
2.4.3. Выявление ЛД- и ТД-фракций гликогена в одной и той же клетке и определение их содержания 76
2.4.4. Анализ стабильности альдегидных групп, образовавшихся в остатках глюкозы гликогена при обработке препаратов йодной кислотой 78
2.4.5. Экстрагирование фракций гликогена из гепатоцитов с помощью трихлоруксусной кислоты и KOH 2.5. Оценка степени заполнения внешних ярусов в молекуле гликогена 79
2.6. Выбор оптимальных условий исследования структуры -частицы гликогена с помощью метода FRET 80
2.6.1. Влияние порядка окрашивания клеток реактивами типа Шиффа на уровень FRET-сигнала 80
2.6.2. Исследование структуры молекул гликогена с помощью конфокальной микроскопии с применением метода FRET (AB) 80
2.6.3. Определение расстояния между остатками глюкозы в -частицах гликогена 81
2.6.4. Расчет R0 для пары Au-EtBr 81
2.7. Статистическая обработка полученных данных 82
ГЛАВА 3. Результаты 83
3.1. Микроскопическая структура печени крысы и человека в норме и при хроническом гепатите 83
3.1.1. Микроскопическая структура печени крысы в норме и при циррозе, вызванном воздействием CCl4 83
3.1.2. Микроскопическая структура печени человека в норме и при циррозе 3.2. Полиплоидия и гипертрофия гепатоцитов крысы и человека в норме и при циррозе печени 85
3.3. Общая характеристика гликогенеза в гепатоцитах нормальной и цирротической печени крысы и человека 87
3.3.1. Динамика накопления гликогена в гепатоцитах нормальной и цирротической печени после введения глюкозы голодным крысам 87
3.3.2. Содержание общего гликогена в гепатоцитах человека в норме, при хроническом гепатите и циррозе печени
3.4. Исследование зависимости содержания общего гликогена в гепатоцитах нормальной и цирротической печени от степени их плоидности на разных стадиях рефидинга крыс 89
3.5. Изменение сухой массы гепатоцитов различных классов плоидности в нормальной и цирротической печени крысы в ходе гликогенеза 93
3.6. Сухая масса гепатоцитов различных классов плоидности у человека в норме, при хроническом гепатите и циррозе печени в постабсорбтивном периоде 95
3.7. Зависимость содержания общего гликогена в клетках от их размера в популяциях гепатоцитов различных классов плоидности нормальной и цирротически измененной печени крысы 98
3.8. Зависимость содержания общего гликогена в клетках от их массы в различных классах плоидности гепатоцитов человека в норме, при хроническом гепатите и циррозе печени 99
3.9. Содержание макрогликогена и прогликогена в гепатоцитах нормальной и цирротической печени крысы и человека
3.10. Доля остатков глюкозы на внешних ярусах молекул гликогена в гепатоцитах нормальной и цирротической печени крысы и человека 108
3.11. Динамика заполнения внешних ярусов -частиц гликогена в популяции гепатоцитов нормальной и цирротической печени крысы в ходе гликогенеза 110
3.12. Степень заполнения внешних ярусов -частиц гликогена в популяции гепатоцитов нормальной и патологически измененной печени человека 115
3.13. Эффективность FRET в гепатоцитах крысы в ходе гликогенеза 116
3.14. Изменение расстояния между цепями глюкозных остатков в -частицах гликогена в гепатоцитах крысы в ходе гликогенеза. 120
3.15. Эффективность FRET и ее распределение в цитоплазме гепатоцитов человека в постабсорбтивном периоде 124
3.16. Расстояние между цепями глюкозных остатков в -частицах гликогена в гепатоцитах человека в постабсорбтивном периоде 125
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 128
Заключение 147
Выводы 148
Список литературы 149
