Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Растительные стерины: химическая структура и многообразие молекулярных видов 14
1.2. Функции стеринов в растениях
1.2.1. Стерины как компонент мембран 22
1.2.2. Роль стеринов в трансдукции сигнала 24
1.2.3. Роль стеринов в росте и развитии растений 27
1.2.4. Роль стеринов в стрессовом ответе растительных клеток 29
1.3. Стерин-связывающие агенты: нистатин и метил--циклодекстрин 34
1.3.1. Нистатин 34
1.3.2. Метил--циклодекстрин
1.4. Биосинтез растительных стеринов 39
1.5. С24-стерин метилтрансфераза растений
1.5.1. Общая характеристика ферментов семейства SMT 45
1.5.2. Гены SMT: структура и транскрипционная активность 49
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 54
2.1. Объект исследования 54
2.2. Анализ липидов
2.2.1. Экстракция липидов из растительного материала .54
2.2.2. Анализ фосфо- и гликолипидного состава проростков пшеницы методами высокоэффективной тонкослойной хроматографии и денситометрии 55
2.2.3. Анализ стеринового состава проростков пшеницы методами тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии с ионизацией электронным ударом .56 2.3. Определение проницаемости плазмалеммы для ионов калия и протонов .57
2.4. Определение выхода электролитов и индекса мембранной стабильности 57
2.5. Анализ размера (Deff) и -потенциала частиц MCD, -ситостерина и комплекса MCD/-ситостерин 58
2.6. Определение окислительно-восстановительного статуса
2.6.1. Содержание перекиси водорода 58
2.6.2. Уровень перекисного окисления липидов.. 58
2.6.3. Aктивность пероксидазы
2.7. Определение уровня жизнеспособности клеток 59
2.8. Флуоресцентная визуализация аутофагосом 59
2.9. Выделение тотальной РНК и синтез кДНК при помощи ОТ-ПЦР
2.9.1. Амплификации участков кДНК с помощью ПЦР в реальном времени 61
2.9.2. Анализ относительного уровня экспрессии генов 63
2.10. Выделение геномной ДНК растений 64
2.10.1. Амплификация участков гомеологичных генов 65
2.10.2. Амплификация и секвенирование промоторных областей гомеологичных генов
2.11. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 67
2.12. Молекулярное клонирование ДНК 67
2.13. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 68
2.14. Биоинформатический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 69
2.15. Статистическая обработка данных 69
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 70
3.1. Действие стерин-связывающих агентов MCD и нистатина на корни проростков пшеницы .70
3.1.1. Изменения липидного состава корней пшеницы при действии MCD 73
3.1.2. Влияние стерин-связывающих агентов на физиологические параметры клеток корней пшеницы .77
3.2. Действие низкой положительной температуры на проростки
пшеницы .84
3.2.1. Изменения индекса мембранной стабильности и редокс-статуса в корнях и листьях 84
3.2.2. Изменения липидного состава в корнях и листьях проростков пшеницы: стерины, гликолипиды, фосфолипиды 89
3.3. Характеристика С24-стерин метилтрансферазы пшеницы 98
3.3.1. Биоинформатический анализ белка TaSMT1 98
3.3.2. Идентификация и характеристика гомеологичных генов пшеницы TaSMT1 .102
3.3.3. Экспрессия генов TaSMT1 в условиях холодового стресса 107
3.3.4. Клонирование и секвенирование промоторных областей генов TaSMT1 .109
Заключение 113
Выводы .116
Список литературы
