Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Инфекционные осложнения у больных гемобластозами 15
1.2 Лабораторная диагностика бактериемий и сепсиса 22
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
2.1 Характеристика обследованных контингентов 43
2.2 Отбор материала для исследования 45
2.3 Материалы исследования 45
2.3.1 Используемые штаммы микроорганизмов 45
2.3.2 Расходные материалы 47
2.3.3 Характеристика оборудования 49
2.4 Микробиологические методы исследования 50
2.5 Молекулярно-биологические методы исследования 51
2.5.1 Полимеразная цепная реакция 51
2.5.2 Секвенирование 52
2.6 Статистическая обработка результатов 52
Собственные данные 53
Глава 3. Характеристика инфекций кровотока у онкогематологических больных 53
3.1 Видовой состав бактерий, выявляемых в крови пациентов с гемобластозами 53
3.2 Выявление микромицетов в крови онкогематологических больных 57
3.3. Анализ видового состава возбудителей инфекций кровотока у пациентов с гемобластозами за последние 8 лет (2008-2015 гг.) 59
3.4 Частота выявления вирусов группы герпеса в крови онкогематологических больных c бактериальными и грибковыми осложнениями 61
ГЛАВА 4. Разработка молекулярно-биологических методов выявления бактерий в крови 67
4.1 Выявление бактерий в цельной крови и определение их грампринадлежности методом ПЦР-РВ 67
4.1.1 Подбор праймеров, зондов и режимов амплификации для выявления участка 16S рРНК, общего для всех бактерий 67
4.1.2 Подбор праймеров и зондов для определения грампринадлежности бактерий 70
4.1.3 Сравнение чувствительности и специфичности разработанного метода определения бактерий в биологическом материале с микробиологическим методом культивирования в системе BacT/ALERT 72
4.1.4 Оптимизация методов выделения, очистки и концентрации бактериальной ДНК из цельной крови 75
4.1.5 Инактивация фоновой бактериальной ДНК при постановке ПЦР на выявление участка 16S рРНК и определения грампринадлежности бактерий 82
4.2 Метод родовой и видовой идентификации бактерий в гемокультуре с использованием ПЦР в режиме «реального времени» 87
4.2.1 Определение чувствительности разработанного метода идентификации бактерий в сравнении с общепринятым микробиологическим методом 89
4.2.2 Оптимизация методов выделения ДНК микроорганизмов из гемокультуры 91
4.2.3 Проверка специфичности разработанного метода идентификации бактерий в модельных опытах с искусственной бактериальной контаминацией крови 97
4.2.4 Сравнение результатов амплификации на приборах Rotor-Gene и АНК-32 111
4.2.5 Оптимизация состава реакционной смеси для исключения ложноотрицательных результатов при проведении ПЦР-РВ вразработанном методе 120
4.2.6 Оценка эффективности разработанного молекулярно биологического метода родовой и видовой идентификации бактерий в крови больных 124
4.3 Алгоритм выявления и видовой идентификации бактерий в крови с использованием ПЦР в режиме «реального времени» 130
Заключение 133
Выводы 149
Практические рекомендации 150
Список сокращений 151
Список литературы 154
