Введение
Обзор литературы 13
1. Общие сведения о цитохром с-оксидазе 13
1.1. Дыхательная цепь 13
1.2. Цитохром с-оксидаза 15
1.3. Редокс-цикл цитохром c-оксидазы аа3 18
1.4. Представления о передвижении протонов внутри фермента 20
2. Спектры поглощения гемопротеидов 22
2.1. Основные сведения о структуре и электронных спектрах поглощения порфиринов...22
2.2. Терминология и теоретическая интерпретация электронных спектров порфиринов...28
2.3. Возможные причины расщепления B- и Q-полос гемопротеидов 32
2.5. Спектры поглощения ЦО 36
3. Спектроскопия кругового дихроизма гемопротеидов 41
3.1. Физическая природа кругового дихроизма 41
3.2. Происхождение сигнала КД гемопротеидов
3.2.1. Оптическая активность свободных гемов 43
3.2.2. Взаимодействие гемов с белковым окружением 45
3.2.3. КД гемопротеидов с модифицированным гемом 47
3.3. Методы расчета спектров кругового дихроизма 50
3.3. Круговой дихроизм ЦО 51
4. Взаимодействие ЦО с кальцием 52
4.1. Избирательный спектральный сдвиг, вызываемый кальцием 52
4.2. Ингибирование активности ЦО кальцием 56
Материалы и методы 58
1. Препараты 58
2. Измерения
2.1. Спектры поглощения 58
2.2. Исследования фотовыцветания гемов с помощью фемтосекундной спектроскопии ...58
2.3. Круговой дихроизм 62
2.4. Регистрация быстрой кинетики восстановления 63
3. Обработка данных 63
Результаты 64
Глава 1. Определение абсолютных спектров поглощения восстановленных гемов а и а3 ЦО.64
1.1. Реконструкция индивидуального спектра поглощения восстановленного гема а на
основе избирательного спектрального сдвига этого гема при связывании Ca2+ 64
1.1.1. Абсолютный спектр поглощения гема а 64
Реконструкция -полосы гема а2+ 67
Реконструкция формы полосы Соре гема а2+ 67
1.1.2. Предварительная оценка абсолютного спектра восстановленного гема а3 в области Соре 71
1.2. Избирательное фотовыцветание 77
1.2.1. Избирательное фотовыцветание гема а32+ в цитохром с-оксидазе ba3 из Thermus thermophilus 77
1.2.2. Избирательное фотовыцветание гемов а2+ и а32+ в цитохром с-оксидазе аa3 из сердца быка 81
1.2.3. Выделение «чистых» спектров фотовыцветания гемов а и а3 в ЦО сердца быка 85
1.3. Разделение разностных спектров поглощения гемов а и а3 с помощью исследования быстрой кинетики восстановления ЦО 96
1.3.1. Определение разностного спектра «восстановленный минус окисленный» для гема а3 в области -полосы 96
1.3.2. Обнаружение вклада CuA в изменения поглощения гемов в видимой области...100
1.4. Ингибирование кальцием переноса электронов через гем а 106
1.4.1. Ингибирование переноса электронов к гему а 106
1.4.2. Ингибирование переноса электронов от гема а к гему а3 108
Глава 2. Круговой дихроизм цитохром с-оксидазы 114
2.1. Экспериментальные данные по круговому дихроизму цитохром с-оксидазы 114
2.1.1. Спектры КД цитохромоксидазы без лигандов 114
2.1.2. Спектры КД оксидазы ba3 115
2.1.3. Спектры КД комплексов ЦО аа3 с CO и CN– 118
2.2. Расчет спектров ЦО с помощью модели диполь-дипольного взаимодействия 123
2.2.1. Формулировка модели 123
2.2.2. Результаты расчетов 128
2.2.3. Вклад отдельных гемов в спектры КД и поглощения 133
2.2.4. Влияние отдельных аминокислотных остатков 136 2.2.4. Влияние взаимодействий с дипольными моментами переходов в пептидных
связях 139
Обсуждение 141
1. Индивидуальные спектры поглощения восстановленных гемов а и а3 в полосе Соре: сравнение с литературными данными 141
2. Расщепление полосы Соре восстановленного гема а 148
3. Расщепление полосы Соре восстановленного гема а3 150
4. Различия спектров поглощения гема а32+ в оксидазах аа3- и ba3-типа 157
5. Происхождение оптической активности ЦО 160
Заключение 163
Выводы 164
Благодарности 166
