Введение
1. Обзор литературы 13
1.1 Надсемейство цитохромов Р450
1.1.1 Бактериальные (водорастворимые) Р450-содержащие системы 15
1.1.2 Микросомальные Р450-зависимые монооксигеназные системы 17
1.1.3 Митохондриальные Р450-зависимые монооксигеназные системы 21
1.1.4 Каталитический цикл микросомальных Р450 22
1.1.5 Основные типы реакций, катализируемые цитохромами Р450 25
1.1.6 Цитохромы Р450 человека и их значение 26
1.1.7 Цитохромы Р450 1А2 и 2В4 27
1.2 Экспрессия эукариотических цитохромов Р450 в Escherichia coli 28
1.2.1 Общие принципы создания экспрессионных систем Р450 29
1.2.2 Водорастворимые формы Р450 30
1.2.3 Оптимизация экспрессии 31
1.2.4 Очистка рекомбинантных цитохромов Р450 32
1.3 Пространственная структура Р450 36
1.3.1 Консервативные структурные последовательности Р450 38
1.3.2 Роль N-концевого региона и пролин-богатого участка эукариотических Р450 40
1.3.3 Гипервариабельные участки Р450 (модель Гото) 41
1.3.4 Роль заряженных аминокислотных остатков молекулы Р450 в межмолекулярных взаимодействиях с компонентами монооксигеназных систем эукариот 44
Заключение по обзору литературы 46
2. Материалы и методы 47
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы и приборы
2.1.2 Ферменты нуклеинового обмена 48
2.1.3 Бактериальные штаммы и ДНК
2.1.4 Среды и антибиотики 49
2.1.5 Олигонуклеотиды, использованные в работе 50
2.2 Методы 51
2.2.1 Компьютерное моделирование модифицированных форм CYP 1А2
2.2.2 Методики клонирования и микробиологические методы
2.2.3 Методики химии белков ->й
2.2.4 Аналитические и биофизические методы исследований "2
3. Результаты и обсуждение 68
3.1 Создание экспрессионных систем
3.1.1 Выбор участка для введения сайта протеолиза в молекулу CYP 1А2
3.1.2 «Кассеты экспрессии» 71
3.1.3 Оптимизирование условий культивирования штаммов Е. coli-продуцентов рекомбинантных цитохромов 72
3.1.4 Оптимизация условий экспрессии рекомбинантных Р450 2В4 в ферментере 82
3.1.5 Анализ экспрессии рекомбинантных цитохромов 2В4 и 1А2 методом иммуноблоттинга 83
3.2 Выделение и очистка вариантов рекомбинантных CYP450 2В4 и 1А2 85
3.2.1 Очистка GST/2B4(A2-27) и GST/2B4(A2-27)/His6 с помощью глутатион-Сефарозы 86
3.2.2 Очистка CYP450 с концевыми полигистидиновыми модификациями 89
3.2.3 Разностные спектры поглощения некоторых очищенных рекомбинантных цитохромов Р45 0 93
3.3 Ферментативные характеристики модифицированных форм CYP450 2В4 и 1А2 95
3.3.1 Энзиматические свойства вариантов CYP450 2В4 96
3.3.2 Энзиматические свойства CYP450 1А2 (HAS) 97
Заключение 98
Выводы 100
Благодарности 101
Список литературы 102
