Введение
1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 9
1.1. Нейтрофил в защитных реакциях организма 9
1.1.1. Пути активации нейтрофила 9
1.1.2. Гранулярный аппарат нейтрофилов 12
1.1.3. Респираторный взрыв 14
1.1.4. Миграция активированных нейтрофилов 14
1.1.5. Фагоцитоз 16
1.2. Кислород-зависимые механизмы инактивации микробов нейтрофилами 17
1.2.1. Активные формы кислорода 17
1.2.2. МПО-система 20
1.3. Кислород-независимые механизмы инактивации микробов нейтрофилами 26
1.3.1. Катионные антимикробные пептиды 26
1.3.2. Лизоцим 28
1.3.3. Серпроцидины 34
1.3.4. Лактоферрин 38
1.4. Кооперативные взаимодействия антимикробных белков нейтрофилов 44
2. Методы исследования 48
2.1. Получение биологического материала 48
2.3.1. Получение экссудата 48
2.1.1. Получение кишечного сока 48
2.2. Выделение антимикробных белков из нейтрофилов экссудата собаки 48
2.2.1. Экстракция катионных белков из целых лейкоцитарных клеток 48
2.2.2. Ионообменная хроматография 49
2.2.3. Гель-фильтрационная хроматография 49
2.3. Электрофоретические методы 50
2.3.1. Электрофорез в кислой буферной системе 50
2.3.2. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия 50
2.4. Секвенирование N-концевого фрагмента белков 51
2.5. Определение молекулярной массы белков 51
2.6 Определение углеводного компонента в белках 52
2.7. Спектрофотометрические исследования 55
2.7.1. Определение степени чистоты миелопероксидазы 55
2.7.2. Определение степени насыщения ЛФ железом 55
2.7.3. Установление спектров поглощения ЛФ и МПО в видимой области . 55
2.8. Изучение связывания ЛФ с железом 55
2.8.1. Получение апоЛФ 55
2.8.2. Получение холоЛФ 55
2.8.3. Диссоциация комплекса ЛФ-железо 56
2.9. Определение активности ферментов 56
2.9.1. Определение пероксидазной активности 56
2.9.2. Определение эстеразной активности эластазы 57
2.9.3. Определение эстеразной активности катепсина G 58
2.9.4. Определение активности лизоцима 59
2.9.5. Ингибиторный анализ 59
2.10. Иммунохимические исследования 60
2.10.1. Получение антисывороток к белкам 60
2.10.2. Выделение из сыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания 60
2.10.3. Иммуноаффинная хроматография 60
2.10.4. Конъюгация антител с пероксидазой хрена 61
2.10.5. Твердофазный иммуноферментный анализ 62
2.11. Определение антимикробной активности белков 64
2.12. Статистическая обработка результатов 66
3. Результаты исследования 67
3.1. Выделение антимикробных белков из нейтрофилов собаки 67
3.2. Определение N-концевой аминокислотной последовательности белков 70
3.3. Физико-химические свойства белков 77
3.3.1. Молекулярная масса белков 77
3.3.2. Определение углеводного компонента в белках 77
3.3.3. Спектрофотометрические исследования 78
3.3.4. Связывание ЛФ с железом 78
3.4. Энзимологические исследования 78
3.4.1. МПО 78
3.4.2. Эластазаи катепсин G 83
3.4.3. Лизоцим 87
3.5. Иммунохимические исследования 87
3.6. Изучение антимикробной активности белков 90
3.6.1. Определение минимальной ингибирующей концентрации белков 90
3.6.2. Изучение кооперативных взаимодействий белков 90
3.6.3. Изучение ферментативной активности белков в присутствии других белков 98
4. Обсуждение результатов 100
4.1. Выделение антимикробных белков 100
4.2. Свойства выделенных белков 102
4.3. Иммунохимические исследования 107
4.4. Антимикробная активность белков 108
5. Выводы 117
6. Список литературы 119
