Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1 Семейство белков синуклеинов 10
1.1.2 Альфа-синуклеин 15
1.1.3 Гамма-синуклеин 18
1.2 SNARE белки 21
1.2.1 Синтаксин-1 23
1.2.3 SNAP-25 24
1.2.2 Синаптобревин-2/VAMP2 25
1.2.4 Нейрональный SNARE-комплекс 26
1.3 Роль альфа-синуклеина в регуляции формирования SNARE-комплекса 29
1.4 Недостаточность альфа-синуклеина, как фактор развития синаптической дисфункции 30
1.5 Моделирование синаптической дисфункции в CSP-a нокаутных мышах 34
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1 Экспериментальные животные 36
2.2 Биохимические методы анализа 37
2.2.1 Генотипирование нокаутных животных 37
2.2.2 ПЦР в реальном времени 39
2.2.3 Получение синаптических везикул 40
2.2.4 Денатурирующий электрофорез в ПААГ 42
2.2.5 Иммуноблоттинг 42
2.2.6 Получение рекомбинантных синуклеинов 44
2.2.6.1 Клонирование 44
2.2.6.2 Продукция рекомбинантных синуклеинов в бактериальных системах 44
2.2.6.3 Очистка рекомбинантных синуклеинов из бактериального штамма-производителя 47
2.2.7 Клеточные культуры 48
2.2.7.1 Приготовление культуральных сред 48
2.2.7.2 Ведение клеточных культур 48
2.2.7.3 Дифференцировка клеточной культуры SH-SY5Y 49
Глава 3. Результаты и их обсуждение 50
3.1 Получение линии бессинуклеиновых мышей 50
3.1.1 Получение линии двойного нокаута по генам альфа- и гамма-синуклеинов 50
3.1.2 Получение линии бессинуклеиновых животных – тройного нокаута по генам альфа-, бета- и гамма-синуклеинов 54
3.1.3 Подтверждение отсутствия всех трех белков синуклеинов в тканях мышей полученной линии abg-KO 59
3.2 Анализ связывания рекомбинантного гамма-синуклеина с синаптическими везикулами 60
3.2.1 Получение рекомбинантных синуклеинов 63
3.2.2 Связывание рекомбинантных синуклеинов с синаптическими везикулами 65
3.3 Анализ связывания рекомбинантного гамма-синуклеина с белками SNARE-комплекса 66
3.3.1 Получение рекомбинантных GST-конъюгированных синуклеинов 67
3.3.2 Анализ связывания рекомбинантных GST-конъюгированных синуклеинов с белками SNARE-комплекса 72
3.3.2.1 Связывание синуклеинов с синаптобревином-2/VAMP2
75
3.3.2.2 Связывание синуклеинов с синтаксином-1 77
3.3.2.3 Связывание синуклеинов с SNAP-25 78
3.3.2.4 Роль С-концевого домена альфа-синуклеина в связывании с белками SNARE-комплекса 81
3.4 Исследование эффекта повышенной продукции гамма-синуклеина на дегенерацию синапсов, вызванную нарушением функции CSP-а 82
3.4.1 Получение повышенной экспрессии гамма-синуклеина в нервной системе CSP-a нокаутных мышей 84
3.4.2 Повышенная экспрессия экзогенного гамма-синуклеина в нервной системе CSP-a нокаутных мышей не влияет на прогрессию нейродегенеративного процесса 87
3.4.3 Анализ уровня гамма-синуклеина в синаптических везикулах CSP-а-/-/ Thy1mtg мышей 91
3.5 Гамма-синуклеин в дифференцированной по нейрональному типу культуре клеток нейробластомы человека SH-SY5Y 93
Выводы 97
Список литературы 98
Список работ, опубликованных по теме диссертации 119
