Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Экспрессия генов теплового шока: общие аспекты 8
1.2. Классификация и функции БТШ 10
1.3. Регуляция экспрессии генов ТШ 19
1.4. Изменения в аппарате транскрипции и трансляции при ТШ 27
1.5. Функции БТШ в апоптозе 30
1.6. Структура и эволюция генов ТШ 32
1.7. БТШ в адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания 40
1.8. БТШ в медицине и экологии 47
2. Материалы и методы 51
2.1. Материалы 51
2.1.1 Линии и виды Drosophila 51
2.1.2. Штаммы Е. coli 51
2.1.3. Клоны hsp70 D. melanogaster 51
2.1.4. Ферменты рестрикции 51
2.1.5. Олигонуклеотиды для анализа связывания факторов транскрипции с элементами ТШ 52
2.1.7. Антитела 52
2.2. Методы 52
2.2.1. Условия содержания дрозофил 52
2.2.2. Условия теплового шока 52
2.2.3. Определение базальной и индуцибельной термоустойчивости 52
2.2.4. Включение метионина -3iS в белки 52
2.2.5. Подсчёт общего включения метионина- S в белки 53
2.2.6. Диск-электрофорез белков с ДЦС-Na (по Лэммли) 53
2.2.7. Двумерный электрофорез белков по ОФарреллу 54
2.2.8. Иммуноблоттинг 54
2.2.9. Иммунопреципитация 55
2.2.10. Очистка белков методом препаративного электрофореза 55
2.2.11. Обработка белка модифицированным трипсином для построения пептидных карт 56
2.2.12. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами ТШ 56
2.2.13. Включение радиоактивной метки в ДНК 57
2.2.14. Выделение геномной ДНК 57
2.2.15. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 57
2.2.16. Электрофорез ДНК 58 2.2Д7. Перенос и гибридизация по Саузерну 58
2.2.18. Определение числа копий гена по Саузерну 58
2.2.19. Выделение тотальной РНК 59
2.2.20. Электрофорез РНК 59
2.2.21. Нозерн-гибридизация 60
2.2.22. Получение геномных фаговых библиотек 60
2.2.23. Скрининг фаговых геномных библиотек 60
2.2.24. Выделение ДНК бактериофага А, 61
2.2.25. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов 61
2.2.26. Выделение фрагментов ДНК 62
2.2.27. Клонирование фрагментов ДНК 62
2.2.28. Трансформация компетентных клеток 62
2.2.29. Выделение плазмидной ДНК 62
2.2.30. Секвенирование ДНК 63
3. Результаты 64
3.1. Определение базальной термоустойчивости у видов и линий группы virilis ,64
3.2. Определение индуцированной термоустойчивости у видов и линий группы virilis 66
3.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов D, virilis и D. lummei 61
3.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei 69
3.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке 70
3.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ70 73
3.7. Исследование ДНК-связывающей активности HSF 73
3.8. Анализ паттерна БТШ70 и динамики синтеза отдельных групп БТШ методом двумерного электрофореза 74
3.9. Идентификация белков по молекулярным массам пептидов 77
3.10. Рестрикционный и Саузерн-анализ генов hsp70 D. virilis 80
3.11. Определение числа копий гена hsp70 у разных линий D, virilis и D. lummei 86
3.12. Определение структуры кластера генов hsp70 D. virilis и Д. lummei на основе рекомбинантных фагов X 90
3.13. Определение нуклеотидной последовательности генов hsp70 и прилежащих участков D, lummei и D. virilis 95
Обсуждение результатов 96
Выводы 106
Список литературы 107
