Введение
1. Векторы дрожжей в изучении организации решшкативного аппарата у дрожжей-сахаромицетов 9
1.1. Векторы дрожжей-сахаромицетов 10
I.I.I. Интегративные векторы ......... 10
I.I.2s. Векторы, способные к автономной репликации 14
1.1.2.1. Векторы эпиеомного типа .... 14
1.1.2.2. Репликативные векторы 15
1.1.2.3. Центромер-содержащие векторы 17
1.1.2.4. Линейные векторы 18
I.I.3. Проблема определения копийности автономно-реплицирующихся векторов дрожжей . . 19
1.2. Организация последовательностей ДНК у дрожжей,
функционально значимых для репликации . .... 22
1.2.1. Свойства хромосомных репликаторов дрожжей » ....22
1.2.2. Репликатор плазмидной омикронной ДНК 27
1.2.3. Центромерные последовательности хромосом дрожжей ..............29
1.3. Заключение. Постановка задачи исследования 35
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы 36
2.1. Штаммы микроорганизмов ......36
2.2. Среды и условия культивирования микроорганизмов 39
2.3. Генетический анализ штаммов дрожжей ...... 40
2.4. Выделение ДНК 40
2.4.1. Выделение бактериальных плазмид ... 40
2.4.2. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей 41
2.4.3. Выделение общей ДНК из дрожжей . .... 42
2.5. Анализ ДНК 43
2.5.1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции . 43
2.5.2. .Цитирование фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы фага Т4 . . . . 45
2.5.3. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 46
2.6. Генетическая трансформация .....46
2.6.1. Трансформация бактерий 47
2.6.2. Трансформация дрожжей . 47
2.6.2.1. Трансформация дрожжей с использованием сферопластов . . 47
2.6.2.2. Трансформация дрожжей с использованием интактных клеток ... 49
2.6.3. Определение митотической стабильности гибридных плазмид ........... 50
3. Результаты исследований 51
3.1. Конструирование гибридных центромерннх плазмид, несущих различные репликаторы дрожжей . .... 51
3.1.1. Конструирование плазмиды Yip-СЕЫЗ t содержащей хромосомный репликатор арпЗ 51
3.1.2. Конструирование плазмиды YEP-CEN3 , содержащей репликатор омикронной ДНК ... 54
3.2. Митотическая стабильность гибридных центромерннх плазмид в различных штаммах дрожжей ... 57
3.3. Определение числа копий центромерннх плазмид в трансформированной клетке дрожжей . . . . . . 60
3.4. Генетическое исследование признака стабильного поддержания центромерной плазмиды Rcp-СЕЫЗ , несущей репликатор рДНК, в штамме ІА-Д38І2 . . 62
3.5. Исследование поведения гибридной плазмиды, несущей репликатор рДНК у моносомиков по хромосоме Г 63
3.6. Математическая модель, описывающая потерю центромерннх плазмид при нитотических делениях трансформантов дрожжей 65
3»7. Конструирование двурепликаторных центромерннх плазмид и изучение их свойств . 69
3.7.1. Конструирование плазмид, содержащих два репликатора рДНК дрожжей 69
З»7.2. Конструирование илазмиды, несущей тандемную дупликацию хромосомного репликатора 72
3.7.3. Митотическая стабильность центромерных плазмид, содержащих два репликатора
рДНК 72
3.7.4. Митотическая стабильность центромерной плазмиды, содержащей два хромосомных репликатора арп I ........... 77
3.7.5. Генетический анализ трансформантов дрожжей, содержащих двурешшкаторные центро-мерные плазмиды ............ 77
3.8. Изучение клеточного контроля функции центромер-ного локуса GEN3 у дрожжей ......... 81
3.8.1. Отбор мутанта с нестабильным поддержали-» ем центромерных плазмид ........ 82
3.8.2. Генетический анализ признака пониженной митотической стабильности центромерных плазмид в штамме P2-GRFIS/I 84
3.8.3. Митотическая стабильность хромосом у мутанта P2-GRF18/1 ...........84
4. Обсуждение полученных результатов ..88
4.1. Использование гибридных центромерных плазмид для изучения свойств хромосомных репликаторов дрожжей ... ................. 88
4.2. Проблема создания амплифипибельных векторов у дрожжей .................... 93
4.3. Нестабильность центромерных векторов и их кольцевая структура ................ 95
4.4. Изучение работы центромерных локусов дрожжей с использованием гибридных плазмид 97
Выводы .....100
литературный указатель 103
