Введение
1. Обзор литературы. Регуляторная роль белка Hfq в жизнедеятельности бактериальных клеток 6
1.1. Образование комплексов белка Hfq с некоторыми мРНК как фактор регуляции трансляции 8
1.2. Участие белка Hfq в регуляции трансляции rpoS мРНК малыми нетранслируемыми РНК Е. coli 13
1.3. Hfq — белок, неспецифически связывающийся с РНК 17
1.4. Роль Hfq в метаболизме поли(А) 18
1.5. Участие Hfq в формировании бактериального нуклеоида 20
1.6. Белок Hfq - Sm-подобный белок бактерий 21
1.7. Пространственные структуры белка Hfq и его гомологов 25
2. Материалы
2.1. Химические реактивы и ферменты 34
2.2. Растворы 35
2.3. Питательные среды 36
2.4. Бактериальные штаммы 36
2.5. Плазмиды 36
3. Методы
3.1. Методы генной инженерии
3.1.1. Выделение хромосомной ДНК Е. coli 38
3.1.2. Выделение плазмидной ДНК Е. coli 38
3.1.3. Очистка плазмидной ДНК равновесным центрифугированием в градиенте CsCl 39
3.1.4. Получение компетентных клеток Е. coli 39
3.1.5. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК 40
3.1.6. Получение штамма-суперпродуцента белка Hfq Е. coli 40
3.1.7. Получение штамма-су пер продуцента белка Hfq P. aeruginosa 41
3.1.8. Получение штаммов, продуцирующих селенометиониновые производные белков EcoHfq и PaeHfq 43
3.1.9. Получение конструкций для транскрипции in vitro OxyS, RprA, RyhB и DsrA РНК 43
3.2. Методы работы с белками
3.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного белка EcoHfq 46
3.2.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка PaeHfq 47
3.2.3. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS 48
3.3. Анализ гомогенности и оценка молекулярных весов полученных препаратов EcoHfq и PaeHfq
3.3.1. Проведение гель-фильтрационной хроматографии препарата белка EcoHfq 48
3.3.2. Проведение аналитического ультрацентрифугирования в шлирен-системе препаратов белков EcoHfq и PaeHfq 49
3.4. Методы работы с РНК и РНК-белковыми комплексами
3.4.1. Т7 транскрипция in vitro OxyS, DsrA, RprA и RyhB РНК 50
3.4.2. Гель-электрофорез РНК в ПААГ в присутствии 8 М мочевины 50
3.4.3. Получение и очистка равномерно Р-мечешнлх DsrA, RprA и RyhB РНК 51
3.4.4. Определение кажущихся констант диссоциации РНК-белковых комплексов 51
3.4.5. Метод гель-шифта 52
3.5. Кристаллизация белка PaeHfq 53
3.6. Сбор дифракционных данных 53
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Получение штаммов-суперпродуцентов белков Hfq Е. соІІ и P. aeruginosa 55
4.2. Выделение гомогенных растворимых препаратов белков EcoHfq и PaeHfq из штаммов-суперпродуцентов 57
4.3. Проверка гомогенности полученных белковых препаратов 60
4.4. Получение регуляторных DsrA, RprA, RyhB и OxyS РНК Е. coli 63
4.5. Исследование РНК-связывающих свойств белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa 65
4.6. Кристаллизация белка Hfq P. aeruginosa 68
4.7. Сбор дифракционных данных 70
Выводы 72
Список цитируемой литературы 73
