Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1.Феномен плюрипотентности клеток млекопитающих in vivo и in vitro 17
1.2. Сигнальные пути, участвующие в поддержании клеточной плюрипотентности 19
1.2.1. LIF-STAT3 19
1.2.2. ВМР4 21
1.2.3. WNT 22
1.3. Транскрипционные факторы и плюрипотентность 23
1.3.1 Транскрипционный фактор ОСТ4 23 1.3.2. Транскрипционный фактор NANOG 26
1.4. Спектр генов-мишеней транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG. Авторегуляция и взаимодействие с другими транскрипционными факторами 28
1.4.1. Гены-мишени транскрипционного фактора ОСТ4 28
1.4.2. Анализ распределения сайтов посадки факторов ОСТ4, NANOG и SOX2 в геномах ЭСК человека и мыши 31
1.5. Структура и хромосомная локализация Oct4 и Nanog. Структура белков
OCT4HNANOG 37
1.5.1. Структура и хромосомная локализация гена Oct4. Структура белка ОСТ4 37
1.5.2. Предшественники гена Oct4 плацентарных млекопитающих 38
1.5.3. Структура и хромосомная локализация гена Nanog. Структура белка NANOG 40
1.6. Динамика экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе млекопитающих 42
1.6.1. Экспрессия гена Oct4 42
1.6.2. Экспрессия гена Nanog 45
1.7. Регуляция экспрессии генов Oct4 и Nanog 46
1.7.1. Регуляция экспрессии гена Oct4 46
1.7.2. Регуляция экспрессии гена Nanog 5 О ЗАКЛЮЧЕНИЕ 53
ГЛАВА 2. Материалы и методы 54
2.1 Объект исследования 54
2.2. Скрининг геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis 54
2.3. Выделение ДНК фагов 55
2.4. Микробиологические методы работы 56
2.4.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli 56
2.4.2. Трансформация компетентных клеток Е.coli 57
2.5. Методики работы с рекомбинантной ДНК 57
2.5.1. Выделение плазмидной ДНК 57
2.5.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 58
2.5.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 58
2.5.4. Выделение фрагментов ДНК из гелей 58
2.5.4. Субклонирование фрагментов ДНК 59
2.7. Полимеразная цепная реакция 59
2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 60
2.9. Контекстный анализ последовательности ДНК 60
2.10. Конструирование репортерных векторов 63
2.11. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы 64
2.11. Работа с РНК
2.11.1. Выделение РІЖ из эмбрионов и органов полевки М. rossiaemeridionalis 65
2.11.2. Обработка РНК ДНКазой 66
2.11.3. Синтез кДНК 66
2.11.4. 3- и 5-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 67
2.12. Работа с культурами эукариотических клеток 68
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis 71
3.2. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Oct4 млекопитающих 75
3.3. Анализ активности промотора гена Oct4 полевки 84
3.4. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Nanog полевки М. rossiaemeridionalis 86
3.5. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей Nanog гена млекопитающих 91V.
3.6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки M.rossiaemeridionalis 96
Заключение 99
Выводы 102
Список литературы
