Введение
I. Обзор литературы: Семейства генов: организация и структура 9
1.1. Введение 9
1.2. Определение семейства генов . 10
1.3. Как образуются семейства генов? II
1.4. Гены и псевдогены 14
1.5. Размеры семейства генов, 16
1.6. Организация семейств генов 20
1.7. Интронно-экзонная организация генов, входящих в состав семейств 22
1.8. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав семейств . 27
1.9. Семейства генов, кодирующих кристаллины хруста лика глаза 36
1.9.1. Гены, кодирующие ^-кристаллины 40
1.9.2. Гены, кодирующие ^-кристаллины 43
1.9.3. Гены, кодирующие ^-кристаллины 45
1.9.4. Гены, кодирующие -кристаллины 46
1.9.5. Регуляция активности кристаллиновых генов, 47
П. Материалы и методы , 50
П.І. Объект исследования 50
П.2. Препаративное выделение плазмидной ДНК . 50
П.З. Очистка плазмидной ДНК центрифугированием в
градиенте плотности хлористого цезия 52
П.4. Расщепление ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз 53
П. 5. Электрофоретический анализ ДНК 55
П.5.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле 55
П. 5.2. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле . 55
П.6. Детекция фрагментов ДНК 56
П. 7. Гибрид-селектированная трансляция 57
П.7.І. иммобилизация плазмидной ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах 57
П.7.2. Гибридизация поли(А+)РНК с иммобилизованной на нитроцеллголозных фильтрах [32Р]-ДНК 58
П.7.3. Трансляция индивидуальной мШК в бесклеточной системе ретикулоцитов кролика 59 П.8. Электрофорез продуктов трансляции в 12,5^
ПААГ-ДДС-Яа 60
П. 9. Йммунопреципитация продуктов трансляции РНК 61
П. 10. Детекция меченых полипептидов в ПААГ-ДДС-Na . 63
ЇЇ.ІЇ. Мечение ДНК in vitro с помощью метода никтрансляции 63
П. 12. Перенос РНК на нитроцеллюлозу и гибридизация с [32Р]-ДНК . 65
П.13. Мечение 3 —концов рестрикционных фрагментов ДНК с помощью Кленовского фрагмента ДНК-по-лимеразы I Е. coli 67
П. 14. Мечение рестрикционных фрагментов ДНК по 5-
концам с помощью полинуклеотидкиназы 68
П. 15. Разделение комплементарных цепей меченых фрагментов ДНК в ПМГ 69
П. 16. Элюция меченых фрагментов ДНК из ЇЇААГ 70
П.17. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 71
П.І7.І. Химические реакции специфической модификации и расщепления меченых фрагментов ДНК 71
П.17.2. Секвенирувдие (структурные) ПААГ 73
Ш. Результаты; 75
Ш.І. Выделение и характеристика клонов, кодирущих и -кристаллины лягушки . 75
Ш.2. Рестрикционное картирование кДНК вставки клона pRt (1 ) 27 85
Ш.З. Первичная структура кДНК вставки клона pRt (1 ) 27 91
Ш.4. Анализ последовательности кДНК клона pRt (1 ) 27 98
Ш.5. Рестрикционное картирование и частичное сек-венирование кДНК вставок клонов pRt (і ) и pRt (і ) 57. Ill
Ш.6. Сравнительный анализ генов, кодирующих кристаллины. 114
Ш.7. Сравнение аминокислотных последовательностей -кристаллинов 118
Ш.8. Сравнение /-кристаллинов с другими белками. 122 Ш.9. Идентификация клона рекомбинантной кДНК, кодирувдей ^А2-кристаллин 128
Ш.9.І, Рестрикционное картирование кДНК вставки клона pRt (1 ) 297 128
Ш.9.2. Нуклеотидная последовательность кДНК вставки клона pRt (l ) 297 130
ШЛО. Сравнение генов, кодиррщих ШЛІ. Наличие частичной гошлогии Аз-кристаллинов с другими белками . 145
IV. Обсуждение результатов 149
Выводы
