Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Генные сети 12
1.2. Структурная геномика 19
1.2.1. Методы реконструкции изоформ мРНК любого гена человека 20
1.2.2. Методы, позволяющие установить геномную структуру любой изоформы мРНК гена (прошлое и настоящее) 26
1.2.3. Стратегии построения полной транскрипционной карты генома человека 28
1.3. Функциональная геномика 30
1.3.1. Как реконструировать генетическую сеть? 31
1.3.2. Методы исследования регуляции экспрессии различных изоформ мРНК одного гена 33
1.3.3. Способы изучения белок - белковых взаимодействий 41
1.3.4. Исследования экспрессии совокупности генов на уровнях транскрипции и трансляции 50
1.4. Современное состояние исследований генов района ql4.3 хромосомы 13 человека, утрачиваемого при многих онкологических заболеваниях 57
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Материалы 63
2.1.1. Оборудование 63
2.1.2. Реактивы и расходные материалы 63
2.1.3. Фотоматериалы 64
2.1.4. Ферментные препараты 64
2.1.5. Штаммы клеток, использованные в работе 64
2.1.6. Библиотека рекомбинантных космидных клонов ICRF С108 65
2.1.7. Библиотека рекомбинантных космидных клонов LANL13NC01 65
2.1.8. Экспрессионная кДНК библиотека для дрожжевой двугибридной системы 66
2.2. Методы 66
2.2.1. Среды, условия хранения и культивирования бактерий 66
2.2.2. Выделение плазмидной и космидной ДНК из клеток Е. coli. 68
2.2.3. Выделение дрожжевой ДНК 70
2.2.4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 71
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 72
2.2.6. Клонирование фрагментов ДНК 73
2.2.7. Трансформация в штаммы клеток 75
2.2.8. Выделение тотальной РНК из культуры клеток 78
2.2.9. Приготовление радиоактивно меченых ДНК-зондов 79
2.2.10. Рестрикционный анализ ДНК и Саузерн-блоттинг 80
2.2.11. Гибридизация Саузерн- и нозерн-блотов. Гибридизация на колониях 82
2.2.12. Процедуры полимеразной цепной реакции (ГЩР) 83
2.2.13. ОТ-ПЦР 84
2.2.14. Эксперимент по достройке праймера 85
2.2.15. Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера 86
2.2.16. Проверка взаимодействия двух белков в двугибридной системе 87
2.2.17. Тест на присутствие в дрожжах белка, кодируемого репортерным геном lacZ. 88
2.2.18. Метод "потери плазмид" 89
2.3. Программное обеспечение, использованное в работе 90
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 92
3.1. Космидный контиг области, содержащей гены RFP2, RFP20S, C130RFlnKCNRG 92
3.2. Экзон-интронная структура и возможная функция гепа. RFP2 94
3.2.1. Картирование гена RFP2 94
3.2.2. Изоформы мРНК гена RFP2 95
3.2.3. Экзон-интронная структура гена RFP2 100
3.2.4. Анализ профиля экспрессии гена RFP2 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека 102
3.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформмРНК гена RFP2 104
3.2.6. Ортологи гена RFP2 105
3.2.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном RFP2 106
3.2.8. Поиск партнеров белка RFP2 методом дрожжевой двугибридной системы 112
3.2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы 113
3.2.10. Возможная функция гена RFP2 119
3.3. Экзон-интронная структура и возможная функция гена RFP20S. 120
3.3.1. Картирование гена RFP20S 120
3.3.2. Структура изоформы РНК гена RFP20S 121
3.3.3. Возможная функция гена RFP20S 122
3.4. Экзон-интронная структура и возможная функция гена KCNRG. 123
3.4.1. Картирование гена KCNRG 123
3.4.2. Экзон-интронная структура гена KCNRG 123
3.4.3. Анализ профиля экспрессии гена KCNRG в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека 127
3.4.4. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформмРНК гена KCNRG 128
3.4.5. У тепа KCNRG, вероятно, присутствует собственная промотерная область 129
3.4.6. Ортологи гена KCNRG 130
3.4.7. Анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых геном KCNRG 130
3.4.8. Возможная функция белкового продукта гена KCNRG... 134
3.5. Экзон-интронная структура и возможная функция гена C130RF1 135
3.5.1. Картирование гена C130RF1 135
3.5.2. Реконструкция изоформ мРНК гена C130RF1 136
3.5.3. Экзон-интронная структура гена C130RF1 139
3.5.4. Анализ профиля экспрессии гена C130RF1 в нормальных тканях и опухолевых клеточных лигиях человека 144
3.5.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена C130RF1 147
3.5.6. Ортологи гена C130RF1 147
3.5.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном C130RF1 149
3.5.8. Поиск партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы 151
3.5.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы 152
3.5.10. Возможная функция гена C130RF1 153
4. Заключение 155
5. Выводы 160
6. Список литературы 162
7. Приложения 194
