Введение
2. Антимикробные пептиды беспозвоночных 7
2.1. Структура антимикробных пептидов беспозвоночных 12
2.1.1. Цистеин-содержащие пептиды 14
2.1.1.1. Пептиды с CSaP структурой 14
2.1.1.2. Пептиды, образующие двойной р-складчатый лист 21
2.1.1.3. Другие цистеин-содержащие пептиды 25
2.1.2. Линейные пептиды с a-спиральной структурой 33
2.1.3. Пептиды, обогащенные пролином 42
2.1.4. Антимикробные белки, обогащенные глицином 47
2.2. Биологическая активность 53
2.2.1. Антимикробная активность 53
2.2.1.1. Стадии взаимодействия пептидов с мембраной 55
2.2.1.2. Механизмы повышения проницаемости мембраны 59
2.2.1.3. Селективность мембранотропного действия 64
2.2.1.4. Альтернативные механизмы антимикробного действия 68
2.2.2. Другие виды активности 76
3. Материалы и методы 81
3.1. Оборудование 81
3.2. Реактивы и расходные материалы 82
3.3. Методы 86
3.3.1. Выделение суммарной РНК 86
3.3.2. Обратная транскрипция и амплификация концов кДНК (RACE)... 87
3.3.3. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР 89
3.3.4. Гетерологичная экспрессия антимикробных пептидов 89
3.3.4.1. Создание генно-инженерных конструкций 89
3.3.4.2. Получение штаммов-продуцентов 92
3.3.4.3. Оптимизация условий экспрессии 92
3.3.4.4. SDS-электрофорез 93
3.3.5. Выделение и очистка рекомбинантных пептидов 94
3.3.5.1. Препаративная экспрессия 94
3.3.5.2. Получение нерастворимой фракции клеточного белка 94
3.3.5.3. Металло-хелатная хроматография 95
3.3.5.4. Расщепление гибридных белков 95
3.3.5.5. Растворение пептидов 96
3.3.5.6. Ультрафильтрация 96
3.3.5.7. ВЭЖХ-очистка пептидов 96
3.3.5.8. Анализ фракций 97
3.3.6. Определение антимикробной активности 97
3.3.6.1. Метод радиальной диффузии в твердой питательной среде 97
3:3.6.2. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде .:.. 98
Результаты и обсуждение 100
4.1. Определение полных последовательностей кДНК, кодирующих предшественники антимикробных пептидов ареницинов из морского кольчатого червя Arenicola marina, и соответствующей им полной аминокислотной последовательности препроареницинов 100
4:2. Определение полной последовательности кДНК, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aurita, и соответствующей полной аминокислотной последовательности препроаурелина 112
4.3. Гетерологичная экспрессия и очистка антимикробных пептидов 122
4.3.1. Экспрессия и очистка ареницина-2 123
4.3.2. Экспрессией очистка буфорина-2 135
4.4. Антимикробная активность ареницина-2 и буфорина-2 138
Заключение 141
Выводы 142
Благодарности 143
Библиографический список 144
