Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы 9
1.1.1 Строение никотиновых рецепторов 9
1.1.2 Механизм передачи сигнала через никотиновый рецептор. 14
1.1.3 Не-нейрональные холинергические сигнальные системы 17
1.2. Трехпетельные белки семейства Ly-6/uPAR 27
1.2.1 Трехпетельные нейротоксины из яда змей 28
1.2.2 Белки Ly-6/uPAR с GPI-якорем у млекопитающих 29
1.2.3. SLURP-1 – аминокислотная последовательность и процессинг 31
1.2.4. Взаимодействие рекомбинантных аналогов SLURP-1 с nAChR 34
1.2.5. Участие SLURP-1 и SLURP-2 в регуляции пролиферации и воспалительных процессов 36
1.2.6 SLURP-1 и SLURP-2 в развитии раковых заболеваний 38
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1 Материалы 41
2.1.1. Реактивы и ферменты 41
2.1.2. Бактериальные и эукариотические клеточные линии 42
2.1.3. Плазмидные векторы 42
2.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур 42
2.1.5. Питательные среды для роста эукариотических клеточных линий 43
2.1.6. Антитела 44
2.1.7. Синтетические олигонуклеотиды 45
2.2 Методы 46
2.2.1 Получение рекомбинантных белков rSLURP-1 и rSLURP-2 46
2.2.2. Аффинная экстракция из образцов тканей 50
2.2.3 Вестерн-блоттинг 52
2.2.4. Электрофизиология 53
2.2.5 Культивирование эукариотических клеток 54
2.2.6. Анализ пролиферативной активности 56
2.2.7 Культивирование клеток РС12 и анализ фосфорилирования ERK1/2 MAP-киназы 56
2.2.8 Конфокальная микроскопия 57
2.2.9 Проточная цитометрия 58
2.2.10 ПЦР в реальном времени 59
2.2.11 Связывание с мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами 60
2.2.12 Исследование структуры и динамики с помощью ЯМР 61
2.2.13 Численное моделирование комплексов rSLURP-2/nAChR 61
Глава 3. Результаты и обсуждение 64
3.1 Рекомбинантный SLURP-1: мишени, механизм действия, пространственная структура 64
3.1.1. Аффинная экстракция субъединиц nAChR с помощью rSLURP-1 64
3.1.2. Конкурентное связывание rSLURP-1 с изолированными nAChR 65
3.1.3. Действие rSLURP-1 на функцию ионного канала nAChR 66
3.1.4 rSLURP-1 подавляет пролиферацию оральных кератиноцитов Het 1A 69
3.2.5. Пространственная структура белка rSLURP-1 73
3.2. Рекомбинантный SLURP-2: мишени, механизм действия, пространственная структура 76
3.2.1 Аффинная экстракция мишени rSLURP-2 76
3.2.2 Действие rSLURP-2 на функцию ионного канала nAChR 77
3.2.3. Рекомбинантный SLURP-2 модулирует пролиферацию кератиноцитов Het-1A через взаимодействие с nAChR и mAChR 80
3.2.4. Влияние rSLURP-2 на связывание лигандов mAChR 82
3.2.5. Пространственная структура белка rSLURP-2 84
3.2.6. Моделирование комплексов rSLURP-2 с nAChR. 89
3.3. Влияние rSLURP-1 и rSLURP-2 на пролиферацию раковых клеток 92
3.3.1 rSLURP-1 и rSLURP-2 подавляют рост раковых линий эпителиального происхождения 92
3.1.2. Взаимодействие rSLURP-1 с EGFR и 7-nAChR в клетках А431 96
3.1.3. Влияние rSLURP-1 на экспрессию эндогенных белков SLURP-1 и 7-nAChR в клетках линии А431 100
Заключение 103
Выводы 104
Благодарности 105
Список литературы 106
