Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации ДНК 9
1.2. Классификация и номенклатура ферментов СРМ 9
1.3. Системы рестрикции-модификации типа II:
их структурно-функциональная организация и биоразнообразие 11
1.4. Структурные особенности эндонуклеаз рестрикции типа II
в эволюционном аспекте 14
1.5. Механизмы взаимодействия эндонуклеаз типа II с ДНК 23
1.5.1. Процессы связывания и узнавания ДНК эндонуклеазами типа II 23
1.5.2. Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа II 26
1.6. Система рестрикции-модификации Eco29kI и ее основные характеристики 32
1.7. Анализ структурной организации эндонуклеазы Eco29kI 33
2. Методы исследований и материалы 35
2.1. Штаммы бактерий, бактериофаги и плазмидные вектора 35
2.2. Выделение и очистка ДНК 35
2.3. Клонирование гена эндонуклеазы Eco29kI-N6His 36
2.4. Сайт-специфический мутагенез in vitro 36
2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 39
2.6. Получение бактериальной массы 39
2.7. Экспрессия гена эндонуклеазы Eco29kI 39
2.8. Выделение и очистка эндонуклеазы рестрикции Eco29kI-N6His и её мутантных форм до гомогенного состояния в нативных условиях 40
2.9. Определение ферментативной активности эндонуклеазы Eco29kI-N6His и её мутантных форм 41
2.10. Тестирование никазной (штриховой) активности мутантных форм эндонуклеазы рестрикции Eco29kI 41
2.11. Ограниченный протеолиз Eco29kI 42
2.12. Электрофорез 43
2.12.1. Электрофорез белков в ПААГ 43
2.12.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 43
2.13. КД - спектроскопия 43
2.14. Анализ специфического узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI 44
2.15. Поляризационный флуоресцентный анализ 45
2.16. Анализ комплексообразования эндонуклеазы Eco29kI 46
2.17. Стехиометрический анализ (Метод Ферпосона) 47
2.18. Реакция гидролиза плазмидной ДНК 48
2.19. Реакция гидролиза модифицированного субстрата 49
2.20. Быстрые реакции Eco29kI 50
3. Результаты исследования и их обсуждение 51
3.1. Особенности ДНК-белкового взаимодействия эндонуклеазы рестрикции Eco29kI 51
3.2. Стехиометрия комплекса Eco29kI с ДНК 56
3.3. Каталитический механизм: кинетика расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Eco29kI 57
3.4. Мутационный анализ каталитического центра эндонуклеазы рестрикции Eco29kI 63
Заключение 71
Выводы 74
Список литературы
