Введение
I. Литературный обзор
1.1. Локализация энтеропептидазы 7
1.2. Структура энтеропептидазы 7
1.3. Активация проэнтеропептидазы 14
1.4. Трипсиноген - физиологический субстрат энтеропептидазы 14
1.4.1 Структурные модификации в процессе активации трипсипогеиа 17
1.5. Специфичность энтеропептидазы 19
1.6. Использование энтеропептидазы для процесс и нга химерных белков 22
1.7. Вторичная специфичность сериновых протеиназ 23
1.8. "Энтеропептидазный линкер" -(Asp)4Lys- в составе природных белков 28
1.9. Роль ионов кальция в энтеропептидазном катализе
1.9.1. Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы 30
1.9.2. Эффект ионов кальция на энтеропептидазный гидролиз 32
II. Результаты и обсуждение 36
Глава 1. Структура и иерархия субстрат-связывающих центров энтеропептидазы 38
1.1 Первичная и вторичная специфичность энтеропептидазы в сравнении с трипсином
1.1.1. Первичная специфичность 38
1.1.2. Вторичная специфичность 41
1.2. Эффективность энтеропептидазы 51
1.2.1. Субстрат Z-Lys-S-Bzl 54
1.2. Модификация трипсина и трипсипогеиа для обнаружения доменов субстрата, взаимодействующих с SII-центром энтеропептидазы
1.2.2.1. ДФФ-трипсин
1.2.2.2. Ацетилированный трипсиноген
Глава 2. Особенности энтеропептидазного катализа
2.1. Лимитирующая стадия
2.2. Эффект ионов кальция
Глава 3. Пептидные субстраты как модели природных и искусственных белковых субстратов энтеропептидазы. Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы
3.1. Гидролиз "неспецифических"субстратов энтеропептидазы как модель автолиза
3.2. N-концевые пептиды мутантных катионных трипсиногенов человека K23R и D22G
3.3. "Неспецифический" энтеропептидазный гидролиз белков
3.4. Потенциальные и экспериментально обнаруженные центры автолиза энтеропептидазы
3.5. Физиологическая роль кальций-зависимого автолиза трипсина и тяжелой цепи энтеропептидазы
III. Экспериментальная часть
1. Материалы
2. Методы
2.1. Очистка энтеропептидазы
2.2. Определение белка
2.3. Определение активности энтеропептидазы
2.4. Определение активности трипсина
2.5. Определение кинетических параметров гидролиза синтетических субстратов
2.5.1. Определение кинетических параметров гидролиза Z-Lys-S-Bzl
2.5.2. Определение кинетических параметров гидролиза модельных пептидов
2.6. Изучения влияния ионов кальция на эффективность энтеропептидазного гидролиза
2.7. Определение лимитирующей стадии реакции гидролиза ряда синтетических субстратов энтеропептидазой 108
2.8. Получение апо-формы полноразмерной энтсропептидазы и ее укороченной формы 111
2.9. Получение ДФФ-трипсина 111
2.10. Получение ацетилированного трипсиногена 113
2.10.1. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на процесс активации трипсиногена энтеропептидазой 113
2.10.2. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на гидролиз GD^K-Nfa энтеропептидазой 114
2.11. Гель-электрофорез 114
2.12. Масс-спектрометрический анализ 114
Выводы 115
Список литературы 116
