Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Липоксигеназный каскад превращения полиненасыщенных жирных 15 кислот
1.2. Общая характеристика цитохромов Р450 18
1.3. Цитохромы Р450 клана CYP74 25
1.4. Ферменты CYP74 сигнальных ветвей липоксигеназного каскада: 28
алленоксидсинтазы и гидропероксидлиазы
1.5. Дивинилэфирсинтазы 32
1.6. Эпоксиалкогольсинтазный путь превращения гидроперекисей жир- 36 ных кислот
1.7. Механизмы каталитического действия ферментов CYP74 43
1.8. Оксилипины бурых водорослей 45
1.9. Ectocarpus siliculosus как модельный объект исследований 48
1.10. Постановка цели исследования 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 55
2.1. Методы биоинформатики 55
2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 55
2.3. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле
2.4. Молекулярное клонирование 58
2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 58
2.6. Характеристика используемых бактериальных векторов 59
2.7. Характеристика используемых бактериальных штаммов 60
2.8. Среды для культивирования бактерий 64
2.9. Приготовление компетентных клеток E. coli
2.10. Трансформация компетентных клеток E. coli 66
2.11. Индукция синтеза рекомбинантных белков 67
2.12. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном ге- 68 ле
2.13. Выделение и очистка рекомбинантного белка 69
2.14. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов
2.15. Получение гидроперекисей жирных кислот 71
2.16. Кинетические исследования рекомбинантных ферментов 72
2.17. Проведение реакций, катализируемых рекомбинантными ферментами, с гидроперекисями жирных кислот
2.18. Анализ продуктов реакций, катализируемых рекомбинантными 73
ферментами, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.18.1. Хроматография на обращенной фазе 73
2.18.2. Хроматография на нормальной фазе 74
2.19. Спектральные исследования 74
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 76
3.1. Биоинформационный анализ предполагаемого CYP74-подобного фермента E. siliculosus
3.2. Получение очищенного препарата рекомбинантного фермента CYP5164B1 E. siliculosus
3.3. Идентификация рекомбинантного фермента CYP5164B1 E. siliculosus как эпоксиалкогольсинтазы
3.4. Механизм каталитического действия эпоксиалкогольсинтазы EsEAS E. siliculosus
3.5. Анализ оксилипинового профиля бурых водорослей разных видов 109
3.6. Анализ взаимосвязи структуры и функций цитохромов Р450 клана CYP74
3.7. Получение рекомбинантных ферментов дикого типа – алленоксидсинтазы LeAOS3 томата и дивинилэфирсинтазы NtDES (CYP74D3) табака
3.8. Каталитические свойства мутантных форм EsEAS, LeAOS3 и NtDES
3.9. Значение N-концевой последовательности для каталитического 130
действия EsEAS
Заключение 133
Выводы 139
Список литературы
