Введение
ГЛАВА 1 Разнообразие целентеразин-зависимых фотопротеинов и их свойства 10
1.1 Целентеразин-зависимые фотопротеины 10
1.2 Пространственная структура Са2+-регулируемых фотопротеинов 15
1.3 Механизм биолюминесценции Са2+-регулируемых фотопротеинов гидромедуз 18
1.4 Биолюминесценция ктенофор 23
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований 36
2.1 Характеристика объектов исследований 36
2.2 Приборы и реактивы 36
2.3 Получение кДНК библиотек 36
2.4 Определение видовой принадлежности особей рода Beroe 37
2.5 Скрининг кДНК библиотек 37
2.6 Экспрессия в E. coli и очистка рекомбинантных апобелков 38
2.7 Измерение удельной биолюминесцентной активности 40
2.8 Измерение спектров рекомбинантного беровина и его мутантных форм 41
2.9 Определение чувствительности беровина к ионам кальция 2.10 Кинетические измерения методом «остановленной струи» 42
2.11 Измерения кинетики формирования активного фотопротеинового комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода 43
2.12 Фотоинактивация 45
2.13 Кристаллизация апо-беровина с ионами магния 45
2.14 Молекулярное моделирование 46
2.15 Сайт-направленный мутагенез 47
2.16 Статистическая обработка результатов 47
ГЛАВА 3 Конструирование и скрининг кДНК библиотек, анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, экспрессия, очистка и получение активного рекомбинантного беровина з
3.1 Получение и скрининг кДНК библиотек 48
3.2 Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей беровина 49
3.3 Экспрессия рекомбинантного беровина в E. coli и очистка апобелка 53
3.4 Получение активного беровина 54
ГЛАВА 4 Основные физико-химические свойства беровина 60
4.1 Биолюминесцентные свойства 60
4.2 Спектральные свойства 62
4.3 Фотоинактивация 63
4.4 Чувcтвительность к ионам кальция 65
4.5 Люциферазная активность апо-беровина 67
ГЛАВА 5 Влияние физиологической концентрации ионов магния на биолюминесценцию беровина 70
5.1 Влияние Mg2+ на чувствительность беровина к Са2+ 70
5.2 Влиянеие Mg2+ на кинетику биолюминесцентной реакции 71
5.3. Влияние Mg2+ на стабильность беровина 75
ГЛАВА 6 Структура апо-беровина с ионами магния 77
6.1 Получение кристаллов апо-беровина с Mg2+ 77
6.2 Пространственная структура апо-беровина с Mg2+ 78
6.3. Структура Ca2+-связывающих сайтов беровина 80
ГЛАВА 7 Роль отдельных аминокислотных остатков в биолюминесценции беровина 85
7.1 Модель пространственной структуры беровина, связанного с 2-гидропероксицелентеразином 85
7.2 Биолюминесцентная активность мутантов беровина 92
7.3 Тушение триптофановой флуоресценции апо-беровина и его Trp мутантов целентеразином 96
7.4 Спектральные свойства мутантов беровина 99
7.5 Функциональная роль отдельных аминокислотных остатков в
формировании активного фотопротеинового комплекса 102
Заключение 106
Выводы 110
Список принятых сокращений 112
Список литературы
