Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Терминация трансляции 10
1.1.1. Факторы терминации 1 -го класса 10
1.1.2. Факторы терминации 2-го класса 26
1.2. Вариантные генетические коды 33
1.2.1. Митохондрии 33
1.2.2. Прокариоты 34
1.2.3. Эукариоты 35
1.2.4. Кодирование селеноцистеина и пирролизина 41
1.3. Гипотезы о причинах возникновения вариантных генетических кодов 43
1.3.1. Гипотеза исчезновения кодона 43
1.3.2. Гипотеза минимизации генома 44
1.3.3. Гипотеза «неопределенного интермедиата» 44
1.3.4. Гипотеза точечного мутагенеза eRF 1 45
1.4. Эволюция генетического кода 46
Глава 2.Материалы и методы исследований 50
2.1. Материалы 50
2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды 50
2.1.2. Среды 51
2.1.3. Реактивы 51
2.1.4. Ферменты 52
2.1.5. Олигонуклеотиды 52
2.2. Методы исследований 54
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 54
2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 54
2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК 55
2.2.4. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК 55
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 56
2.2.6. Сайт-направленный мутагенез методом "мегапраймера" 56
2.2.7. Метод мегапраймерной ПЦР со сменой матрицы 57
2.2.8. Амплификация N-концевых частей гена eRFl
Euplotes aediculatus и Stylonychia mytilus 58
2.2.9. Конструирование генов химерных eRFl 58
2.2.10. Синтез и выделение белков 60
2.2.11. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААГ 61
2.2.12. Определение активности eRFl 61
2.2.13. Культура клеток и трансфекция 62
2.2.14. Измерение активности люциферазы и Р-галактозидазы 62
2.2.15. Определение уровня "сквозного прочтения" (readthrough) 63
Глава 3. Результаты исследований 65
3.1. Измерение in vitro RF-активности химерных eRFl стилонихия/человек 65
3.2. Определение влияния химерных eRFl стилонихия/человек на уровень сквозного прочтения в клетках человека 69
3.3. Измерение in vitro RF-активности мутантных eRFl парамеция/человек 72
3.4. Определение влияния химерных eRFl эуплота/человек
на уровень сквозного прочтения в клетках человека 74
Глава 4. Обсуждение результатов 79
4.1. Методы определения специфичности декодирования eRF 1 79
4.2. Специфичность узнавания стоп-кодонов в ресничных определяется N-концевым доменом eRF 1 80
4.3. В ресничных Stylonychia и Paramecium UGA-специфичность достигается за счет различных аминокислотных остатков N-концевого домена eRF 1 82
4.4. Два участка последовательности eRFl эуплоты,
препятствующие декодированию кодона UGA 84
4.5. Аминокислотные остатки eRFl, определяющие специфичность узнавания стоп-кодонов различны в ресничных Stylonychia, Paramecium и Euplotes 87
4.6. Возникновение вариантного генетического кода в ресничных: гипотеза мутагенеза eRF 1 89
4.7. Заключение 90
Выводы 92
Благодарности 93
Список литературы 94
