Введение
Обзор литературы 8
I. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков 8
1. Введение 8
2. Ran-зависимый ядерно-цитоплазматический транспорт белков 9
2.1. Сигналы ядерно-цитоплазматического транспорта и транспортные факторы
10
2.1.1. Сигналы ядерной локализации и кариоферины-а 10
2.1.2. Сигналы ядерной локализации и импортины 12
2.1.3. Сигналы ядерного экспорта и экспортины 13
2.2. Строение ядерного порового комплекса, нуклеопорины 14
2.3. Модель Ran-зависимого транспорта 17
2.3.1. Ran, регуляторы Ran 18
2.3.2. Посадка комплекса кариоферин-а/импортин-|31/с№,8-белок на NPC... 19
2.3.3. Прохождение комплекса кариоферин-сс/импортин-р1/сЫЬ8-белок через центральный канал ядерной поры 20
2.3.4. Разборка комплекса кариоферин-а/импортин-рУсЫЬБ-белок 21
2.3.5. Перемещение белков из ядра в цитоплазму 22
2.3.6. Ran-связывающие белки 23
2.4. Транспорт белков внутренней ядерной мембраны 25
3. Ran-независимый ядерно-цитоплазматический транспорт белков 27
4. Регуляция ядерно-цитоплазматического транспорта 31
4.1. Регуляция транспорта за счёт модуляции взаимодействий
импортина/экспортина с сигналом NLS/NES субстрата 31
4.1.1. Маскирование сигналов NLS/NES субстрата от узнавания импортином/экспортином 31
4.1.1.1. Внутримолекулярное маскирование сигналов NLS/NES субстрата. 31
4.1.1.2. Межмолекулярное маскирование сигналов NLS/NES субстрата 33
4.1.2. Регуляция транспорта за счёт усиления связывания импотрина/экспортина с сигналом NLS/NES субстрата 35
4.1.3. Регуляция транспорта за счёт удержания в цитоплазме или в ядре 36
4.1.4. Регуляция транспорта за счёт котранспортировки и изменения субстрат-связывающих свойств кариоферина 37
4.2. Регуляция транспорта за счёт изменения состава импортинов и экспортинов 38
4.3. Регуляция транспорта за счёт изменения состава нуклеопоринов 39
II. Мультифункциональный ядерно-цитоплазматический белок YB-1 41
1. История открытия белков семейства YB-1 41
2. Структурно-функциональная организация YB-1 43
2.1. Домен холодового шока 45
2.2. С-концевой домен 46
3. Функции YB-1 в ядре 46
3.1. Участие YB-1 в регуляции транскрипции 46
3.2. Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК 49
3.3. Участие YB-1 в сплайсинге 50
3.4. Участие YB-1 в разборке ядрышек 50
4. Функции YB-1 в цитоплазме 51
4.1. Участие YB-1 в трансляции 51
4.2. Участие YB-1 в упаковке мРНК 53
4.3. Участие YB-1 в регуляции стабильности мРНК 55
4.4. Участие YB-1 в локализации мРНК 56
4.5. Участие белков семейства YB-1 в процессинге мРНК 56
5. Ядерно-цитоплазматический транспорт YB-1 57
5.1. Сигнальные последовательности в молекуле YB-1 57
5.2. Механизм ядерно-цитоплазматического транспорта YB-1 58
5.3. Возможные механизмы регуляции ядерно-цитоплазматического транспорта YB-1 59
5.3.1. Регуляция транспорта YB-1 за счёт взаимодействия с мРНК 59
5.3.2. Тромбин стимулирует переход YB-1 в ядро в эндотелиальных клетках 60
5.3.3. Переход YB-1 в ядро в комплексе с другими белками 61
5.3.4. Фосфорилирование YB-1 может влиять на его ядерно-цитоплазматическое распределение 62
6. YB-Іирак 63
Заключение 65
Материалы и методы 66
1. Плазмидные конструкции 66
2. Выделение рекомбинантного YB-1 из Escherichia coli 67
3. Выделение мутантных форм YB-1 из Escherichia coli 68
4. Выделение YB-1-специфичной протеазы и 26S протеасомы из лизата ретикулоцитов кролика 69
5. Электрофорез белков в полиакрипамидном геле в присутствии SDS 70
6. Расщепление YB-1 20S протеасомой 71
7. Фосфорилирование YB-1 71
8. Определение киназ, фосфорилирующих YB-1, в SDS-полиакриламидном геле (ingel kinase assay) 72
9. Обработка препаратов YB-1 рибонуклеазами 72
10. Центрифугирование YB-1-протеазы в градиенте концентрации сахарозы 72
11. Иммунологический анализ белковых препаратов (иммуноблоттинг) 73
12. Культуры клеток. Получение клеточных, ядерных и цитоплазматических экстрактов и метаболическое мечение белков 74
13. Иммунопреципитация 76
14. Иммунофлуоресцентная микроскопия 76
15. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli 77
16. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 78
17. Обработка плазмиды рестриктазами 78
18. Получение транскриптов РНК in vitro 79
19. Мечение РНК по 5-концу и по кэп-структуре 79
20. Электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы 80
21. Анализ изменения подвижности комплексов белок-РНК в геле 80
22. Бесклеточная система трансляции из ретикулоцитов кролика 80
23. Ультрафиолетовая перешивка YB-1 смРНК 81
Результаты
