Введение
Глава 1. Особенности биологии термофильных метанотрофов 8
1.1. Экология и физиология 8
1.2. Общая характеристика термофильных метанотрофов 11
1.3. Метаболизм Methylococcus capsulalus Bath 16
1.3.1. Метанмонооксигеназа, ее роль и регуляция 16
1.3.2. Ассимиляция Сі-соединений 23
1.3.3. Пути ассимиляции азота 27
1.3.4. Биосинтез стеролов 28
1.4. Геномные реконструкции метаболизма «Methylacidiphilum infernorum» ЗО
Глава 2. Особенности адаптации термофильных и термотолерантных прокариот 32
2.1. Тепловой шок 32
2.2. Особенности внутриклеточных структур у термофилов 35
2.2.1. Белки и ферменты термофилов 35
2.2.2. Механизмы стабилизации нуклеотидов 36
2.2.3. Внутриклеточные факторы, стабилизирующие белки и ДНК 37
2.2.3.1. Анионные термопротекторы 37
2.2.3.2. Незаряженные осмолиты 39
2.2.4. Строение цитоплазматических мембран термофильных бактерий 42
2.2.5. Системы антиоксидантной защиты у микроорганизмов 44
Глава 3. Пигменты метанотрофов 48
3.1. Биосинтез меланинов у микроорганизмов 50
3.2. Функции меланина и факторы влияющие на меланогенез 55
Экспериментальная часть 57
Глава 4. Материалы и методы 57
4.1. Объекты исследования 57
4.2. Культивирование метанотрофов 57
4.3. Микроскопические исследования 57
4.3.1. Выявление нуклеоида в целых клетках 58
4.4. Изучение физиологических свойств 58
4.5. Аналитические определения 58
4.6. Идентификация органических осмолитов 61
4.6.1. Аминокислотный анализ 61
4.6.2. Ионообменная тонкослойная хроматография 61
4.6.3. Экстракция термостабильных низкомолекулярных растворимых веществ из клеток 62
4.6.4. Разделение углеводсодержащих низкомолекулярных веществ 62
4.7. Определение включения 14СН4 суспензиями клеток 63
4.8. Определение влияния температуры инкубации на биосинтез белка и окисление метана 63
4.9. Фракционирование клеток .-. 64
4.9.1. Получение бесклеточных экстрактов 64
4.9.2. Определение концентрации белка 64
4.9.3. Электрофорез в ДСН-ПААГ 65
4.10. Определение активности ферментов 65
4.10.1. Определение активности ферментов первичного и центрального метаболизма 65
4.10.2. Определение оптимальной температуры для активности ферментов 72
4.10.3. Определение термостабилизирующего влияния экстракта,
спиртоводорастворимой фракции клеток штамма 0-12 и сахарозы на активность ЛДГ
иФДГ 73
4.11. Выделение ароматических метаболитов из культуральной жидкости 73
4.12. Выделение и изучение свойств меланина 73
4.13. Визуализация перекись - разлагающей активности клеток Md. szegediense 0-12...74
4.14. Молекулярно-генетические методы 74
4.14.1. Выделение и очистка препаратов ДНК 74
4.14.2. ПЦР-амплификация 75
4.14.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 76
4.14.4. Очистка фрагментов ДНК 77
4.14.5. Дотирование фрагментов ДНК 77
4.14.6. Получение компетентных клеток и их трансформация 77
4.14.7. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов 78
Глава 5. Результаты и обсуждение 79
5.1. Цитофизиологические и биохимические свойстваЛ/іі. szegediense 0-12 79
5.1.1. Особенности роста Md. szegediense 0-12 при различных температурах 79
5.1.2. Окисление и ассимиляция метана при разных температурах культивирования адаптированными клетками Md. szegediense 0-12 81
5.1.3. Влияние температуры инкубации на биосинтез белка Mi. szegediense 0-12 82
5.1.4. Цитологические особенности Md. szegediense 0-12 85
5.1.5. Фосфолипидные и жирнокислотные профили клеток Md. szegediense 0-12 и Мс. capsulatus Bath .4 88
5.1.6. Влияние температуры культивирования на активность ферментов первичного и центрального метаболизма 90
5.1.7. Влияние температуры измерения на активность ключевых ферментов Сі метаболизма 95
5.2. Идентификация органических термопротекторов у Md. szegediense 0-12 96
5.2.1. Накопление и путь биосинтеза сахарозы у Md. szegediense 0-12 97
5.2.2. Влияние сахарозы на термостабильность ФДГ и ЛДГ 99
5.3. Системы защиты от активных форм кислорода у термотолерантного и умеренно
термофильного метанотрофов 100
5.3.1. Активности ферментов защиты от АФК 102
5.4. Синтез меланинового пигмента Md. szegediense 0-12 109
5.4.1. Выделение и изучение свойств меланинового пигмента 110
5.4.2. Изучение локализации меланина в клетках Md. szegediense 0-12 112
5.4.3. Поиск предшественника синтеза меланина 113
5.4.4. Расшифровка путей синтеза меланина 115
Заключение 122
Выводы 124
Список литературы 125
