Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор. токсичные метаболиты сине зеленых водорослей и методы их определения 10
1.1 Сине-зеленые водоросли в окружающей среде. Токсичные метаболиты сине-зеле ных водорослей - цианотоксины 10
1.1.1 Нейротоксичные сакситоксины 11
1.1.2 Нейротоксичные анатоксины 16
1.1.3 Гепатотоксичные микроцистины 18
1.2 Другие виды биологической активности изучаемых цианотоксинов 23
1.3.Методы определения цианотоксинов 23
1.3.1 Скрининговые методы анализа 24
1.3.2 Методы селективного определения изучаемых цианотоксинов
1.3.2.1 Хроматографические методы определения цианотоксинов 26
1.3.2.2 Масс-спектрометрические методы определения цианотоксинов 28
1.4 Методы масс-спектрометрии, применяемые для анализа биологических молекул 30
1.4.1 Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации - масс спектрометрии 30
1.4.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия с
электрораспылительной ионизацией 30
1.4.3 Типы современного оборудования для жидкостной хромато-масс-спектро-метрии 31
1.4.4 Идентификационные требования при проведении масс-спектрометрического анализа 33
1.5 Пробоподготовка для масс-спектрометрического анализа микроцистинов 34
ГЛАВА 2 Разработка аналитической процедуры анализа изучаемых цианотоксинов с применением метода масс спектрометрии 37
2.1 Анализ стандартных соединений изучаемых цианотоксинов методом высоко эффективной жидкостной хроматографии- тандемной масс-спектрометрии 37
2.1.1 Хроматографическое разделение 37
2.1.2 Масс-спектрометрическое детектирование 39
2.1.2.1 Масс-спектрометрическое детектирование соединений группы сакситоксинов 40
2.1.2.2 Масс-спектрометрическое детектирование анатоксина-a 41
2.1.2.3 Особенности масс-спектрометрического детектирования микроцистинов
2.1.2.3.1 Зависимость характера спектра от применяемых режимов фрагментации 44
2.1.2.3.2 Фрагментные спектры, получаемые на разных типах приборов 46
2.1.2.3.3 Фрагментные спектры соединений группы микроцистинов 47
2.1.3 Метод одновременного масс-спектрометрического определения анатоксина-а и микроцистинов 54
2.2 Оптимизация процедуры пробоподготовки образцов биомассы для хромато-масс-спектрометрического анализа микроцистинов 54
2.2.1 Одновременная экстракция анатоксина-а и микроцистинов из природной воды 55
2.2.2 Оптимизация процедуры пробоподготовки для анализа микроцистинов из биомассы методом хромато-масс-спектрометрии 56
2.2.2.1 Оценка эффекта обработки биомассы ацетонитрилом до целевой экстракции 56
2.2.2.2 Влияние обработки биомассы ацетонитрилом на эффективность экстракции 58
2.2.2.3 Оптимизация процедуры экстракции микроцистинов из биомассы с использованием водно-ацетонитрильных смесей 60
2.2.2.4. Количественное определение содержания микроцистинов и анатоксина-а в объектах окружающей среды 64
ГЛАВА 3 Применение разработанной аналитической процедуры для исследования распространенности цианотоксинов в водоемах различных регионов России 67
3.1 Определение изучаемых цианотоксинов в озерах Северо-Западного региона России (на примере озер Сестрорецкий разлив и Нижнее Суздальское) 67
3.2 Определение микроцистинов и анатоксина-а в заливах Балтийского моря
3.2.1 Прибрежная зона восточной части Финского залива Балтийского моря 72
3.2.2 Определение цианотоксинов в воде и биомассе Куршского залива 73
3.3 Определение изучаемых цианотоксинов в Волжских водохранилищах 74
3.3.1 Цианотоксины в Рыбинском, Горьковском и Чебоксарском водохранилищах в период аномально жаркого лета 2010 г 74
3.3.2 Цимлянское водохранилище 74
3.4 Определение нейротоксичных циантометаболитов в водоемах Северо-западного, Центрального региона России и Западной Сибири 77
ГЛАВА 4 Методы компьютерного моделирования для прогнозирования биологической активности цианометаболитов 79
4.1 PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances - взаимосвязь «структура активность») 79
4.2 QSAR («Quantitative Structure – Activity Relationship», «количественное
соотношение структура–активность») 82
ГЛАВА 5 Экспериментальная часть 84
5.1 Примененные методы исследования 84
5.2 Приборы и материалы 84
5.2.1 Оборудование для МАЛДИ-МС анализа 84
5.2.2 Оборудование для ВЭЖХ-МС анализа 85
5.2.3 Оборудование для анализа фитопланктона 87
5.2.4 Реактивы 87
5.3 Параметры хромато-масс-спектрометрического анализа 87
5.3.1 Условия хроматографического разделения 87
5.3.2 Условия получения масс-спектров стандартных соединений сакситоксинов 88
5.3.2.1 Условия получения фрагментных масс-спектров высокого разрешения стандартных соединений сакситоксинов 88
5.3.2.2 Условия проведения тандемного масс-спектрометрического анализа при исследовании нейротоксических «цветений» природных водоемов 89
5.3.3 Получение масс-спектров микроцистинов 90
5.3.3.1 Условия получения масс-спектров высокого разрешения микроцистинов 90
5.3.3.2 Получение фрагментных масс-спектров высокого разрешения для идентификации структурных вариантов и изучения фрагментации микроцистинов. 91
5.3.3.3 Условия одновременного масс-спектрометрического определения анатоксина-а и микроцистинов 91
5.4 Условия получения МАЛДИ-МС спектров 92
5.5 Пробоотбор образцов из природных водоемов 92
5.6 Микроскопический анализ образцов фитопланктона 92
5.7 Иммуноферментный анализ 93
5.8 Пробоподготовка образцов для проведения ВЭЖХ-МС анализа цианотоксинов 93
5.8.1 Пробоподготовка образцов биомассы для проведения ВЭЖХ-МС анализа микроцистинов и анатоксина-а 93
5.8.2 Обработка биомассы ацетонитрилом до целевой экстракции микроцистинов 93
5.8.3 Подготовка образцов биомассы для ВЭЖХ-МС анализа нейротоксинов 94
5.8.4 Пробоподготовка образцов природной воды 94
5.8.5 Амплификация участков генов синтеза цианотоксинов 94 5.9 Методы компьютерного моделирования для прогнозирования биологически
активных свойств соединений 95
Заключение 98
Список сокращений 99
Список литературы
