Введение
Глава 1. Структурные основы катализа под действием LOX 12
1.1. Липоксигеназы млекопитающих представляют собой единую полипептидную цепь, которая организована в виде двухдоменной структуры; в низших организмах встречаются гибридные белки 14
1.2. Малый N-терминальный домен LOX является важным структурным элементом, отвечающим за мембранное связывание и каталитическую активность 17
1.3. С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающий карман и каталитически активное негемовое железо 18
1.4. Междоменная подвижность как источник структурной гибкости LOX 20
1.5. Связывание лиганда с активным центром 12/15-LOX кролика приводит к конформационным изменениям белковой матрицы 20
1.6. Субстрат-связывающий карман LOX является гидрофобной полостью с выходом на поверхность белка 22
1.7. Молекулярный кислород проникает в активный центр LOX посредством строго контролируемых механизмов 26
1.8. Первичная структура LOX играет ключевую роль в реакционной специфичности окисления жирных кислот 27
1.9. Антароповерхностный характер и стереоконтроль липоксигеназной реакции 28
1.10. Геометрия трех ключевых аминокислот определяет позиционную специфичность 12/15-липоксигеназ (концепция триады) 31
1.11. Реакционная специфичность 15LOX2 человека и ее ортолога (8S-LOX мыши) не может быть объяснена концепцией триады 33
1.12. Реакционная специфичность изоформ LOX зависит от экспериментальных условий 34
1.13. Суицидальная инактивация LOX 34
1.14. Аллостерический характер LOX 37
1.15. Структура LOX в растворе 38 Глава 2. Эволюция LOX 40
2.1. Гены, кодирующие последовательность липоксигеназ, обнаружены в эукариотах и бактериях, но не найдены в археях 40
2.2. Существует ли общий прототип LOX? 42
2.3. Биологическая роль изоформ LOX 43
Глава 3. Будущее и перспективы развития исследований в области структурной биологии LOX 44
Глава 4. Химический синтез зондов активного центра липоксигеназ 47
4.1. Полный химический синтез терминальных и субтерминальных замещенных производных арахидоновой кислоты 47
4.1.1. Синтез региоизомерных по положению гидроксигруппы терминальных ацетиленов 48
4.1.2. Синтез ю-4/ю-З замещенных оптически активных производных арахидоновой кислоты 50
4.1.3. Синтез терминальных и ш-1/ш-2 субтерминальных замещенных производных арахидоновой кислоты 54
4.2. Синтез зондов активного центра на основе ингибиторов г12/15-1 ОХ 55
Глава 5. Изучение взаимодействия г12/15-1 ОХ с лигандом 62
5.1. Исследования r12/15-LOX с использованием аналогов их природных субстратов 62
5.1.1. Введение фотоаффинной метки в г12/15-LOX 62
5.1.2. Энантиоселективное окисление ґІ2/15-І ОХ региоизомеров ПНЖК гидроксилированных в субтерминальной части молекулы 66
5.2. Исследования r12/15-LOX с использованием ингибиторов липоксигеназного окисления 69
Глава 6. Роль кислорода в реакциях с участием липоксигеназ 72
6.1. Бифазный характер скорости окисления 19-НЕТЕ под действием ҐІ2/15-LOX 72
6.2. Кинетическое моделирование и оценка кинетических параметров 74
6.3. Расчетная модель механизма транспорта кислорода в 12/15-LOX на основе симуляции молекулярной динамики и метода неявного лиганда 77
Глава 7. Изучение пространственной структуры r12/15-LOX в растворе 83
7.1. Вклад контактов между N-терминальным и каталитическим доменами г12/15-1 ОХ в стабильность вторичной и третичной структур белка 83
7.1.1. Анализ взаимодействия N-концевого и каталитического доменов 83
7.1.2. Функциональная роль Туг98 N-терминального домена 85
7.1.3. Структурные изменения фермента при мутациях Туг98 и Туг614 85
7.1.4. Роль N-концевого домена в стабилизации подвижной а2 спирали 89
7.1.5. Анализ третичной структуры и динамики конформационных изменений г12/15-1 ОХ дикого типа и мутантов 90
7.1.6. Вклад Arg403 в стабильность структуры М2/15-LOX 93
7.1.7. Функциональная роль Arg403 в структуре r12/15-LOX 96
7.2. Исследование межмолекулярных контактов г12/15-1 ОХ в растворе 103
7.2.1. Термодинамическая устойчивость димеров липоксигеназы 103
7.2.2. Влияние внешнего окружения на структуру г12/15-1 ОХ в растворе 104
7.2.3. Влияние лиганда на структуру и структурную подвижность г12/15 LOX 106
7.2.4. Исследования интерфейса в димере г12/15-1 ОХ с применением метода малоуглового рассеивания рентгеновских лучей и направленного мутагенеза 109
7.2.5. Изучение устойчивости димеров фермент-субстратного комплекса г12/15-1 ОХ и мутантов с использованием методов молекулярной динамики 113
7.2.6. Влияние межмолекулярных контактов в димерном интерфейсе белка на ферментативные свойствам 2/15-LOX 116
7.2.7. Роль аминокилотных остатков х18 спирали в конформационных переходах r12/15-LOX
Заключение 121
Выводы 123
Экспериментальные статьи 193
Тезисы докладов на научных конференциях 196
Список цитируемой литературы 199
