Введение
Цель и Задачи работы обзор литературы 11
3.1 Суперсемейство K+ каналов 11
3.1.1 K+ каналы входящего выпрямления (Kir) 13
3.1.2 K+ каналы, имеющие два поровых участка (K2P) 15
3.1.3 Потенциал-зависимые K+ каналы (Kv)
3.1.3.1 Доменная организация Kv каналов 16
3.1.3.2 Механизм работы Kv каналов 18
3.1.3.3 Классификация Kv каналов
3.1.3.3.1 Kv каналы задержанного выпрямления 20
3.1.3.3.2 Kv каналы A-типа 22
3.1.3.3.3 EAG каналы 22
3.1.3.3.4 «Модификаторы»
3.1.4 Ca2+-Активируемые K+ каналы малой и средней проводимости (SKCa, IKCa) 23
3.1.5 Ca2+-Активируемые K+ каналы большой проводимости (BKCa) 24
3.1.6 Вспомогательные субъединицы К+ каналов 26
3.2 Лиганды К+ каналов 27
3.2.1 Небольшие органические молекулы 28
3.2.2 Полипептидные токсины
3.2.2.1 Змеи 35
3.2.2.2 Морские анемоны 36
3.2.2.3 Конусы 38
3.2.2.4 Пчелы 40
3.2.2.5 Пауки 41
3.2.2.6 Скорпионы
3.2.2.6.1 Структурные особенности блокаторов К+ каналов из яда скорпионов 44
3.2.2.6.2 Многообразие блокаторов K+ каналов из яда скорпионов 49
3.2.2.6.3 Взаимодействие KTx с К+ каналами 49
3.3 Практическое применение полипептидных лигандов К+ каналов 55
3.3.1 Применение радио- и флуоресцентно-меченых аналогов токсинов 55
3.3.2 K+ каналы как мишень при различных патологиях 56
3.4 Заключение 59
Материалы и методы 60
5.1 Материалы 60
5.1.1 Реактивы 60
5.1.2 Растворы 61
5.1.3 Биологический материал 63
5.1.4 Культуры клеток 63
5.1.5 Лабораторные животные 63
5.1.6 Оборудование 63
5.1.7 Расходные материалы 64
5.1.8 Программное обеспечение 64
5.2 Методы 65
5.2.1 Разработка програмного обеспечения 65
5.2.2 Конструирование и анализ библиотеки кДНК 66
5.2.3 Эксклюзионная хроматография 67
5.2.4 Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 67
5.2.5 Масс-спектрометрия 67
5.2.6 Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия 68
5.2.7 Восстановление дисульфидных связей и алкилирование тиольных групп 69
5.2.8 Отщепление N-концевого остатка пироглутаминовой кислоты 69
5.2.9 Определение N-концевой аминокислотной последовательности 69
5.2.10 Селективный гидролиз полипептидов по остаткам глутаминовой кислоты 70
5.2.11 Синтез гена, кодирующего химерный белок eGFP-OSK1, методом ПЦР 70
5.2.12 Осаждение и очистка ДНК 72
5.2.13 Рестрикция линейных фрагментов ДНК и плазмиды pET-28a 72
5.2.14 Электрофорез ДНК в агарозном геле 72
5.2.15 Лигирование линейных фрагментов ДНК и плазмиды pET-28a 72
5.2.16 Трансформация E. coli методом электропорации 72
5.2.17 Отбор трансформантов c интересующей последовательностью ДНК 73
5.2.18 Выделение плазмидной ДНК 73
5.2.19 Секвенирование ДНК 73
5.2.20 Контролируемая экспрессия гена гибридного белка 73
5.2.21 Выделение растворимой фракции белков E. coli 74
5.2.22 Аффинная хроматография 74
5.2.23 Электрофорез белков в полиакриламидном геле 74
5.2.24 Приготовление сферопластов с гибридными KcsA-Kv каналами 74
5.2.25 Электрофизиологические исследования 75
5.2.26 Получение клеток HEK293T, временно экспрессирующих hKv1.3 76
5.2.27 Приготовление срезов мозжечка крысы и гистохимическое окрашивание 76
5.2.28 Микроскопия 77
5.2.29 Приготовление лимфоцитов для фенотипического анализа 77
5.2.30 Проточная цитометрия 78
5.2.31 Молекулярное моделирование 78
Результаты 79
6.1 Создание специализированной базы данных KTx – Kalium 79
6.1.1 Сбор данных и разработка интерфейса 79
6.1.2 Структура и особенности базы данных Kalium
6.2 Тестирование яда паукообразных на предмет наличия поровых блокаторов K+ каналов 84
6.3 Анализ транскриптома ядовитых желез скорпионов M. eupeus и O. scrobiculosus
6.3.1 Составление библиотек кДНК из ядовитых желез M. eupeus и O. scrobiculosus85
6.3.2 Классификация предполагаемых токсинов и их сравнение с известными KTx 86
6.4 Выделение и характеристика блокаторов K+ каналов из цельных ядов скорпионов 92
6.4.1 Выделение новых KTx из яда M. eupeus с помощью хроматогра-фических методов 92
6.4.2 Анализ хроматографического профиля яда M. eupeus и секвенирование активных компонентов 93
6.4.3 Выделение KTx из яда O. scrobiculosus с помощью хроматографических методов 95
6.4.4 Анализ хроматографических профилей яда O. scrobiculosus и идентификация KTx 97
6.4.5 Физиологическая характеристика новых токсинов 98
6.4.6 Классификация новых KTx, выделенных из яда M. eupeus и O. scrobiculosus... 99 6.5 Создание нового биомолекулярного инструмента на основе KTx для визуализации K+ каналов 101
6.5.1 Дизайн химерного флуоресцентного белка eGFP-OSK1 101
6.5.2 Получение рекомбинантного eGFP-OSK1 103
6.5.3 Физиологическая характеристика eGFP-OSK1 106
6.5.4 Использование eGFP-OSK1 в скрининговых технологиях 108
6.5.5 Использование eGFP-OSK1 для визуализации hKv1.3, временно экспрессированных в клетках HEK293T 109
6.5.6 Применение eGFP-OSK1 для локализации K+ каналов на срезах мозжечка крысы 109
6.5.7 Визуализация K+ каналов с помощью eGFP-OSK1 на поверхности T-лимфоцитов мыши 111
Обсуждение 113
