Введение
2 Обзор литературы 19
2.1 Трансформация стероидных соединений актинобактериями 21
2.1.1 Гидроксилирование 21
2.1.2 Дегидрирование 26
2.1.3 Гидрирование 29
2.1.4 Эпоксидирование 30
2.1.5 Окисление спиртов в кетоны или альдегиды 30
2.1.6 Гидролиз стероидных эфиров 32
2.1.7 Окисление кетонов в эфиры и лактоны (реакция Байера-Виллигера) 32
2.1.8 Восстановление карбонильных соединений 33
2.1.9 Деградация 35
2.2 Трансформация стеринов 37
2.2.1 Стерины и источники их получения 37
2.2.2 Микробиологическая трансформация стеринов 42
2.2.2.1 Деградация боковой цепи 42
2.2.2.2 Окисление стероидного ядра 46
2.2.2.3 Методы предотвращения деструкции стероидного ядра 48
2.3 Ферменты модификации стероидного ядра у актинобактерий
2.3.1 Холестеролоксидаза 54
2.3.2 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа (3-КСД) и получение штаммов с 55 блокированной активностью 3-КСД
2.3.2.1 Индуцибельность 3-КСД -. 56
2.3.2.2 Свойства 3-КСД 57
2.3.2.3 Сходство строения и механизма действия 3-КСД и других дегидрогеназ 58
2.3.2.4 Субстратная специфичность 3-КСД 59
2.3.2.5 Локализация 3-КСД 60
2.3.2.6 Связь 3-КСД с другими ферментными системами клетки 60
2.3.3 Свойства 9а-гидроксилазы 62
2.3.4 Свойства 17-гидроксистероидцегидрогеназ (17-ОН-СДГ) 63
2.3.4.1 Физиологическая роль 17-ОН-СДГ ; 65
2.3.4.2 Субстратная специфичность 17-ОН-СДГ 67
2.3.4.3 Индукция бактериальных 17-ОН-СДГ 67
2.3.4.4 Локализация 17-ОН-СДГ у микроорганизмов 69
2.3.4 Дезацетилирование и свойства стероидных эстераз 69
2.4 Взаимодействие клеток актинобактерий с гидрофобными стероидными субстратами
2.4.1 Строение клеточной стенки микобактерий и ее проницаемость
2.4.2 Взаимодействие актинобактерий со стеринами 73
2.4.3 Модификация структуры КС и трансформация стеринов 75
2.5 Трансформация стероидных соединений в присутствии циклодекстринов (ЦД)
2.5.1 ЦД и их применение 76
2.5.2 Производные ЦД 79
2.5.3 Константа стабильности комплексов ЦД с органическими соединениями
2.5.4 Применение ЦД в биотехнологии 82
2.5.5 Применение ЦД в биотрансформации стероидов 83
Экспериментальная часть
3 Материалы и методы 87
3.1 Материалы 87,
3.1.1 Перечень материалов, использованных в работе 87 3.1.2 СКАМ и получение препаратов на его основе 88Ї
3.2 Микроорганизмы и их культивирование 89
3.2.1 Культивирование актинобактерий 90
3.3 Определение чувствительности микобактерий к антибактериальным агентам 91.
3.4 Селекция и мутагенез микобактерий 91
3.4.1 Индукция мутаций 91
3.4.2 Получение мутантных штаммов микобактерий, продуцирующих 9-ОН-АД . 92
3.5 Трансформация стероидных соединений 93
3.5.1 Трансформация стеринов и ДГЭА в колбах 93
3.5.2 Трансформация СКАМаи его препаратов 93
3.5.3 Трансформация стероидов андростанового и прегнанового ряда 94
3.6 Очистка стероидтрансформирующих ферментов микобактерий 95
3.6.1 Очистка Зр-гидроксистероидоксидазы 97
3.6.2 Очистка 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы (3-КСД) 97
3.6.3 Очистка 17-гидроксистероиддегидрогеназ (17-ОН-СДГ) 98
3.7 Характеристики ферментов 99
3.8 Определение локализации 17-ОН-СДГ 99
3.8.1 Получение сферопластов Mycobacterium sp. Etl 99
3.8.2 Определение локализации 17-ОН-СДГ фракционированием клеток 100
3.8.3 Определение локализации 17-ОН-СДГ цитохимической реакцией 101
3.9 Фракционирование клеток Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д 101
3.10 Изучение влияния модифицированных циклодекстринов (МЦД) на Mycobacterium spp 102
3.10.1 Влияние МЦД на рости агрегацию микобактерий 102
3.10.2 Определение миколовых кислот 103
3.10.3 Определение свободных липидов 103
3.10.4 Определение состава жирных кислот 103
3.10.5 Определение углеводного состава полисахаридов клеточных стенок 104
3.11 Электронная микроскопия 104
3.11.1 Просвечивающая электронная микроскопия 104
3.11.2 Метод замораживания - скалывания 105
3.12 Физико-химические методы 105
3.12.1 Построение фазовых диаграмм растворимости стероидов в растворах ЦД... 105
3.12.2 Определение константы стабильности комплексов ЦД со стероидами 105
3.13 Аналитические методы 106
3.13.1 Выделение и очистка стероидов 106
3.13.2 Анализ стероидов 106
4 Результаты и обсуждение 108
4.1 Трансформация стероидных соединений актинобактериями 108
4.1.1 Идентификация 7-гидроксилированных стероидов 117
4.1.2 Сопоставительный анализ 3-КСД активности штаммов рода Nocardioides... 121
4.1.3 Сопоставительный анализ 17-ОН-СДГ активности штаммов Mycobacterium и Rhodococcus 122
4.1.4 Продукты трансформации ситостерина штаммами Mycobacterium spp 123
4.1.5 Трансформация различных стеринов микобактериями 124
4.1.6 Трансформация стеринсодержащего отхода производства соевого масла... 125
4.1.6.1 Трансформация скама 126
4.1.6.2 Биоконверсия препарата М 128
4.1.6.3 Биоконверсия образцов скама, предобработанных химическими способами 130
4.2 Получение мутантных штаммов Mycobacterium spp 132
4.2.1 Определение чувствительности Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д к антибактериальным препаратам 132
4.2.2 Получение мутантных штаммов из Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815Д, определение их способности к росту на 3,17-дикетостероидах и деградации боковой цепи Р-ситостерина 134
4.2.3 Трансформация 3,17-дикетостероидов мутантными штаммами 137
4.2.4 Мутагенез и селекция штаммов, продуцирующих 9-ОН-АД 139
4.2.4.1 Получение мутантного штамма Mycobacterium sp. 2-4М 139
4.2.4.2 Трансформация ситостерина мутантным штаммом Mycobacterium sp. 2-4М 141
4.2.4.3 Трансформация 3,17-дикетостероидов мутантом Mycobacterium sp. 2-4М... 143
4.3 Ферменты модификации стероидного ядра стеринтрансформирующих микобактерии: выделение, функции и свойства 146
4.3.1 ЗР-гидроксистероидоксидаза (3-СО) 146
4.3.1.1 Очистка внеклеточной 3-СО 147
4.3.1.2 Трансформация стероидов ферментными препаратами 3-СО 149
4.3.1.3 17-ОН-СДГ активность препаратов внеклеточных ферментов 151
4.3.2 17Р-Гидроксистероиддегидрогеназа 153
4.3.2.1 Выделение, очистка и изучение свойств внутриклеточных 17-ОН-СДГ 153
4.3.2.2 Свойства внутриклеточных 17-ОН-СДГ 156
4.3.3 Локализация 17-ОН-СДГ Mycobacterium sp. Etl 158
4.3.3.1 Изучение локализации 17-ОН-СДГ методом фракционирования 158
4.3.3.2 Изучение локализации 17-ОН-СДГ цитохимическим методом 160
4.3.4 3-Кетостероид-1(2)-дегидрогеназаМксо6ас/еп шя sp. ВКМ Ас-1817Д 163
4.3.4.1 1(2)-Дегидрирование 9-ОН-АД и АД 163
4.3.4.2 Индукция 3-КСД 164
4.3.4.3 Очистка 3-КСД 165
4.4 Трансформация стеринов микобактериямн в присутствии МЦД 168
4.4.1 Биотрансформация стеринов в присутствии различных МЦД 168
4.4.2 Константы стабильности комплексов стероидов с МЦД 175
4.4.3 Выяснение связи между основными показателями биотрансформации и физико-химическими характеристиками растворов МЦД. Гипотеза "ЦД емкости среды" 176
4.4.4 Влияние МЦД на деструкцию 9-ОН-АД Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д 179
4.4.4.1 Доказательство образования комплекса включения 9-ОН-АД с МЦД 180
4.4.4.2 Кинетические характеристики процесса дегидрирования 9-ОН-АД 182
4.4.4.3 Изучение доступности комплекса [МЦД - 9-ОН-АД] для 3-КСД 185
4.4.5 Влияние МЦД на рост микобактерии, состав и проницаемость их клеточной стенки 185
4.4.5.1 Влияние МЦД на рост Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1816Д 185
4.4.5.2 Влияние МЦД на адгезивные свойства клеток 187
4.4.5.3 Влияние модификаций КС на стеринтрансформирующую активность 187
4.4.5.4 Взаимодействие клеток с субстратом в присутствии МЦД 188
4.4.5.5 Ультраструктура клеток и клеточной стенки 189
4.4.5.6 Влияние МЦД на химический состав КС 192
4.5 Биоконверсия стероидов прегнанового ряда культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033 197
4.5.1 Биоконверсия прегна-4,9(11)-диен-17а,21 -диол-3,20-диона 197
4.5.2 Конверсия 21 -ацетата прегна-4,9(11)-диен-17сс,21-диол-3,20-диона 199 4.5.3 Биоконверсия 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20 диона 204
4.5.3.1 Изучение возможности неферментативной ацильнрй миграции ацетильной группы 209
4.5.3.2 Влияние рН на биоконверсию диацетата 211
4.5.3.3 Влияние строения прегна-4,9(11)-диеновых стероидов на их конвертируемость 213
4.5.3.2 Биоконверсия 17ос,21 -диацетата прегна-4,9(11)-диен-3,20-дион-17а,21 диола в оптимальных условиях 217
4.5.4 Конверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона 217
4.5.4.1 Влияние индукции 222
4.5.4.2 Влияние биомассы 225
4.5.4.3 Локализация стероид-эстераз 226
4.5.4.4 Селективная биоконверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона в 21-ацетокси-прегна-1(2),4,9(11),16(17)-тетраен-3,20-дион 228
4.6 Биотехнологические методы получения стероидов андростанового и прегнанового ряда 231
4.6.1 Разработка биотехнологического способа получения тестостерона из ситостерина 231
4.6.2 Биотехнологии получения АД, АДД, 9-ОН-АД 234
4.6.3 Биотехнологические методы получения 1 (2)-дегидроаналогов стероидов прегнанового и андростанового ряда 236
Заключение 239
Выводы 244
Список цитированной литературы
