Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Физиолого-биохимическая характеристика бактерий Macromonas bipunctata и Rhodopseudomonas palustris
1.1.1. Особенности метаболизма бесцветных серобактерий М. bipunctata Ю
1.1.2. Эколого-бйохимическая характеристика фототрофных бактерий R. palustris 10
1.1.3. Особенности генома R. palustris 12
1.1.4. Распространение и практическое значение исследуемых бактерий 14
1.2. Сравнительная характеристика МДГ из организмов различных таксономических групп 5
1.2.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ 15
1.2.2. Общая характеристика каталитического действия 16
1.2.3. Кинетические параметры 1?
1.2.4. Влияние концентрации ионов водорода 18
1.2.5. Влияние интермедиатов и ионов 19
1.2.6. Температурный оптимум 22
1.2.7. Особенности малатдегидрогевазной системы организмов, живущих в экстремальных условиях 23
1.2.8. Множественные молекулярные формы МДГ 26
1.3. Характеристика структуры молекулы малатдегидрогеназы 29
1.3.1. Анализ аминокислотного состава МДГ из различных объектов 30
1.3.2. Вторичная, надвторичная и третичная структурные организации белковой молекулы МДГ 36
1.3.3. Строение и механизм действия активного центра МДГ 41
1.3.4. Характеристика четвертичной структуры МДГ 43
1.3.5. Факторы, обеспечивающие стабильность и олигомерное состояние молекулы МДГ 45
1.3.6. Характеристика структуры гена МДГ 50
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 55
2.1. Цель и задачи исследования 55
2.2. Объекты и методы исследования^ 56
2.2.1. Объекты исследования 56
2.2.2. Методы исследования 56
2.2.2.1. Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов 5 6
2.2.2.2. Определение активности ферментов 57
2.2.2.3. Определение количества белка 58
2.2.2.4. Выделение и очистка МДГ 59
2.2.2.5. Электрофоретические исследования 60
2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез 60
2.2.2.5.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 61
2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы 61
2.2.2.5.4. Специфическое проявление изоцитратдегидрогеназы 62
2.2.2.5.5. Специфическое проявление изоцитратлиазы 62
2.2.2.5.6. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ 62
2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента 63
2.2.2.7. Ингибиторный анализ 64
2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов^ 64
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 65
2.3. Полученные результаты и их обсуждение 66
2.3.1. Влияние различных условий культивирования на активность МДГ и некоторых ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла у исследуемых микроорганизмов 66
2.3.1.1. Исследование активности ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла из R. palustris и М. bipunctata 66
2.3.1.2. Изоферментный состав некоторых ферментов из исследуемых бактерий 70
2.3.2. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий родов Macromonas и Rhodopseudomonas 72
2.3.2.1. Очистка малатдегидрогеназы 72
2.3.2.2. Определение гомогенности ферментных препаратов 78
2.3.3. Физико-химические свойства МДГ 78
2.3.3.1. Определение молекулярной массы нативной МДГ из изучаемых объектов 78
2.3.3.2. Определение субъединичного строения МДГ ^ ^ 81
2.3.4. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ 85
2.3.4.1. Влияние концентрации ионов водорода 85
2.3.4.2. Определение константы Михаэлиса 86
2.3.4.3. Определение константы субстратного ингибирования 89
2.3.4.4. Влияние интермедиатов и ионов на активность МДГ 95
2.3.4.5. Температурный оптимум 100
2.3.5. Функциональная роль изоформ МДГ у R. palustris 104
2.3.5.1. Зависимость четвертичной структуры МДГ от условий культивирования R.palustris Ю4
2.3.5.2. Влияние итаконата и малоната на соотношение димерной и 107
тетрамерной изоформ МДГ из пурпурных бактерий R. palustris
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 111
ВЫВОДЫ 115
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 118
