Введение
1. Введение 12
1.1. Актуальность темы 12
1.2. Задачи исследования .13
1.3. Научная новизна исследования 13
1.4. Научно-практическая значимость 14
1.5. Основные положения, выносимые на защиту 14
2. Обзор литературы .15
2.1. Механизмы реализации холинергических эффектов в норме 15
2.1.1. Парасимпатическая иннервация сердца 15
2.1.1.1. Общий план вегетативной иннервации сердца 15
2.1.1.2. Внутрисердечное нервное сплетение 18
2.1.1.2.1. Структура ганглиев внутрисердечного нервного сплетения 18
2.1.1.2.2. Локализация узлов интеркардиального нервного сплетения .19
2.1.1.2.3. Нейрохимия интракардиальных ганглиев .23
2.1.2. Мускариновые рецепторы в миокарде 25
2.1.2.1. Строение и общие принципы работы мускариновых рецепторов .25
2.1.2.1.1. Агонисты и антагонисты мускариновых рецепторов 27
2.1.2.2. Мускариновые рецепторы в сердце 28
2.1.2.3. Физиологическая роль М1-, М4-, М5- рецепторов в сердце .29
2.1.2.3.1. М1-рецепторы 29
2.1.2.3.2. М4-рецепторы 30
2.1.2.3.3. М5-рецепторы .30
2.1.3. Реализация холинергических эффектов в сердце .31
2.1.3.1. М2-рецепторы в сердце 31
2.1.3.1.1. Gi-субъединица и аденилатциклазный сигнальный каскад 31
2.1.3.1.2. -субъединица Gi-белка: активация GIRK-каналов .33
2.1.3.2. М3-рецепторы в сердце млекопитающих .36
2.1.3.2.1. Доказательства наличия функциональных М3-рецепторов в сердце 36
2.1.3.2.2. Внутриклеточные каскады, опосредуемые М3 рецепторами .37
2.1.3.2.3. Фосфоинозитидный сигнальный путь: эффекты инозитолтрифосфата .38
2.1.3.2.4. Фосфоинозитидный сигнальный путь: эффекты диацилглицерола .40
2.1.3.2.5. Калиевый ток IKM3 42
2.2. Особенности холинергичекой стимуляции при возникновении патологических ситуаций в сердце 44
2.2.1. Ишемическое повреждение миокарда и М3-рецепторы .45
2.2.1.1. Цитопротекторные эффекты стимуляции М3-рецепторов 46
2.2.1.2. Влияние активации М3-рецепторов на межклеточное взаимодействие 47
2.2.1.3. Ассоциация между PKC и M3-рецепторами .48
2.2.2. Патологическая гипертрофия сердца и М3-рецепторы 48
2.2.3. Аритмия и мускариновые рецепторы 49
2.2.3.1. Участие М-рецепторов в генезе фибриляции предсердий 49
2.2.3.2. Кардиопротекторная роль М3-рецепторов при фибрилляции желудочков 50
2.2.4. Сердечная недостаточность и М3-рецепторы 51
2.3. Развитие холинегической регуляции в ходе онтогенеза .51
3. Методика 55
3.1. Объекты исследования 55
3.1.1. Препаровка 56
3.1.2. Препараты правого предсердия .56
3.1.3. Препарат стенки правого желудочка .57
3.2. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда 57
3.2.1. Использованные антитела 58
3.2.2. Протокол окраски 58
3.3. Молекулярно-биологические исследования уровня экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени .59
3.3.1. Принцип метода 59
3.3.2. Выделение тотальной РНК из препаратов сердечной мышцы .63
3.3.3. Обработка ДНКазой I 64
3.3.4. Обратная транскрипция 65
3.3.5. Выделение геномной ДНК .65
3.3.6. Праймеры, использованные в работе 66
3.3.7. Полимеразная цепная реакция .67
3.4. Эксперименты с регистрацией электрической активности 69
3.4.1. Устройство установки .69
3.4.2. Регистрация ПД. Протокол эксперимента 70
3.4.3. Обработка результатов 71
3.5. Метод пэтч-кламп 72
3.5.1. Выделение изолированных кардиомиоцитов крысы .72
3.5.2. Регистрация кальциевого тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах методом пэтч-кламп 73
4. Результаты и обсуждение .75
4.1. Доказательства наличия и функциональной активности М3-рецепторов в сердце 4.1.1. Исследование эффектов избирательной стимуляции М3-рецепторов в рабочем миокарде
крысы 75
4.1.1.1. Действие пилокарпина на параметры электрической активности в рабочем предсердном миокарде крысы. Развитие эффекта во времени 75
4.1.1.2. Эффекты избирательной стимуляции М3-рецепторов в предсердном рабочем миокарде крысы 76
4.1.1.3. Исследование эффектов избирательной стимуляции М3-рецепторов в рабочем миокарде стенки правого желудочка крысы 79
4.1.1.4. Сравнение влияния пилокарпина на конфигурацию ПД в предсердиях и желудочках крысы 83
4.1.2. Действие избирательной активации М3-рецепторов на параметры электрической активности различных отделов сердца мыши 84
4.1.2.1. Действие избирательной стимуляции М3-холинорецепторов на параметры электрической активности синоатриального узла мыши 85
4.1.2.2. Исследование влияния избирательной стимуляции М3-холинорецепторов на параметры ПД в препарате ушка правого предсердия мыши .89
4.1.2.3. Действие избирательной активации М3-рецепторов пилокарпином на электрическую активность правого желудочка мыши 92
4.1.2.4. Сравнение действия пилокарпина на параметры электрической активности предсердий и желудочков мыши 95
4.1.3. Иммуногистохимическое исследование миокарда различных отделов сердца мыши на
наличие рецепторных белков М2 и М3-рецепторов 96
4.1.3.1.Иммуногистохимическое окрашивание препарата правого предсердия мыши .97
4.1.3.2. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов правого желудочка
мыши 105 4.1.4. Измерение уровня экспрессии генов мускариновых рецепторов второго и третьего типа методом ПЦР в реальном времени 108
4.1.4.1. Измерение уровня экспрессии генов М2 и М3-рецепторов в сердце крысы 109
4.1.4.2. Измерение уровня экспрессии генов М2- и М3-рецепторов в различных отделах сердца мыши 112
4.2. Механизмы, опосредующие эффекты избирательной стимуляции М3 рецепторов .115
4.2.1. Исследование механизма воздействия стимуляции М3-рецепторов на параметры электрической активности в миокарде .115
4.2.1.1. Исследование роли фосфолипазы С в опосредовании эффектов избирательной активации М3-рецепторов 115
4.2.1.2. Исследование роли саркоплазматических рецепторов IP3 в опосредовании эффектов избирательной активации М3-холинорецепторов 118
4.2.1.3. Исследование роли протеинкиназы С в опосредовании эффектов избирательной активации М3-холинорецепторов 120
4.2.2. Действие стимуляции М3-холинорецепторов на кальциевый ток в предсердных и желудочковых рабочих кардиомиоцитах крысы .122
4.3. Особенности развития холинергической системы в онтогенезе 127
4.3.1. Исследование влияния избирательной стимуляции М3-рецепторов на параметры электрической активности различных отделов сердца новорожденных крысят .128
4.3.1.1. Действие избирательной стимуляции М3-холинорецепторов на параметры ПД в рабочем предсердном миокарде новорожденных крысят .128
4.3.1.2. Действие избирательной стимуляции М3-холинорецепторов на параметры ПД в рабочем желудочковом миокарде новрожденных крысят 131
4.3.2. Исследование избирательной стимуляции М3-рецепторов на параметры электрической
активности миокарда различных отделов сердца трехнедельных крысят 133
4.3.2.1. Действие избирательной стимуляции М3-холинорецепторов на параметры ПД в рабочем предсердном миокарде трехнедельных крысят 133
4.3.2.2. Действие избирательной стимуляции М3-холинорецепторов на параметры ПД в желудочковом миокарде трехнедельных крысят .135
4.3.3. Сравнение эффектов избирательной стимуляции М3-рецепторов на параметры электрической активности миокарда на разных стадиях постнатального развития крысы 136
4.3.4. Измерение уровня транскрипции генов М2- и М3-рецепторов в миокарде крысы на разных стадиях постанатального развития .139
4.3.4.1. Измерение уровня транскрипции генов М2- и М3-рецепторов в миокарде новорожденных крысят 139
4.3.4.2. Измерение уровня транскрипции генов М2- и М3-рецепторов в миокарде трехнедельных крыс 141
4.3.4.3. Сравнение уровня экспрессии генов М2- и М3-рецепторов в миокарде крысы на разных стадиях постнатального развития .142
4.4. Недостатки используемых экспериментальных методик .145
4.5. Возможное физиологическое значение М3-рецепторов .146
5. Заключение .148
6. Выводы 149
7. Список использованной литературы
