Введение
2 Обзор литературы 8
2.1 В-клеточный хронический лимфолейкоз 10
2.2 Организация и перестройка генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара . 17
2.3 Соматическая гипермутация 22і
2.4 Изучение V-генов при лимфатических опухолях 26
2.5 Изучение молекулярных маркеров при В-клеточном хроническом лимфолейкозе 30
2.6 Особенности метода ПЦР в реальном времени 37
3 Экспериментальная часть 52
3.1 Объекты и методы исследования 52
3.1.1 Реактивы 52
3.1.2 Среды 52
3.1.3 Характеристика больных 53
3.1.4 Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМК) и селекция клеток CD 14+, CD4+, CD8+ и CD 19+ 55
3.1.5 Получение препаратов ДНК, РНК и кДНК 55
3.1.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 56
3.1.7 Подготовка стандартов для абсолютного количественного анализа 57
3.1.7.1 Клонирование в плазмиде 57
3.1.7.2 Отбор рекомбинантных ДНК 57
3.1.7.3 Рестрикция ДНК 58
3.1.8 Секвенирование ДНК 58
3.1.9 Создание олигонуклеотидных систем для детекции методом ПЦР- 5 8 *
РВ
3.1.10 Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)
3.1.11 Определение мутационного статуса генов иммуноглобулинов 63
3.1.11.1 Амплификация клонально-перестроенных генов вариабельного региона иммуноглобулинов 63 -
3.1.11.2 Очистка ампликонов и определение их нуклеотиднойпоследовательности 64
3.1.12 Компьютерные программы 66
3.1.13 Статистический анализ 66
3.2 Результаты исследований и их обсуждение 68.
3.2.1 Предыстория работы 68
3.2.2 Разработка и тестирование набора реактивов для ПЦР-РВ 68
3.2.3 Анализ мутационного статуса вариабельного региона генов иммуноглобулинов 82
3.2.4 Выбор референтного гена и генов, перспективных онкомаркеров В-ХЛЛ 86
3.2.5 Оценка уровня транскрипции генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, MYCN nLPL 89
3.2.6 Анализ уровня транскрипции генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, MYCN и LPL в различных субпопуляциях клеток крови 91
3.2.7 Взаимосвязь уровня транскрипции генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, MYCNVLLPL С мутационным статусом 95
3.2.8 Анализ «нетипичных» случаев В-ХЛЛ 97
3.2.9 Взаимосвязь уровня транскрипции генов LPL и DMD с выживаемостью и другими прогностическими факторами 99
3.2.10 Обсуждение результатов 102
Заключение 117
