Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Сомаклональная изменчивость 6
1.1.1. Причины сомаклональной изменчивости 6
1.1.2. Факторы, влияющие на сомаклональную изменчивость 7
1.1.3. Возможные механизмы сомаклональной изменчивости 14
1.1.4. Изменения, возникающие в процессе сомаклональной изменчивости 15
1.1.5. Практическое использование сомаклональной изменчивости 18
1.2. Молекулярные маркеры, применяемые для изучения сомаклональной изменчивости 21
1.2.1. Белковые маркеры 21
1.2.2. RFLP-маркеры 24
1.2.3. PCR-маркеры 28
1.2.3.1. МААР-маркеры 30
1.2.3.1.1. МААР-маркеры с праймерами произвольной последовательности 32
1.2.3.1.2. МААР-маркеры с праймером, комплементарным микросателлитному повтору 35
1.2.3.2. STS-маркеры 37
1.2.3.2.1. STS-маркеры, основанные на полиморфизме микросателлитов 37
1.2.3.2.2. STS-маркеры, созданные на основе МААР 40
1.2.3.2.3. STS-маркеры, основанные на выявлении точковых мутаций при введении нуклеотидных замен в праймеры 41
1.2.3.3. REMAP-маркеры 43
1.2.3.4. Маркеры, сочетающие рестрикцию, гибридизацию и PCR-методы 44
1.2.3.4.1. Использование в качестве мишени ПЦР-продукта 44
1.2.3.4.2. Использование рестрицированной геномной ДНК в качестве основы для ПЦР 44
1.2.3.4.3. FISH (зонды могут быть получены спомощью ПЦР) 48
1.2.3.5. Комплексный подход к анализу сомаклональной изменчивости с помощью молекулярных маркеров 48
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Исходный материал 51
2.2 Выделение ДНК для PCR-анализа 51
2.3. Амплификация ДНК 52
2.4. Проведение электрофореза в агарозном геле 54
2.5. Качественная и количественная оценка полиморфизма 54
2.6. Выделение фрагмента из геля 55
2.7. Клонирование фрагмента 55
2.8. Выделение плазмиды 55
2.9. Секвенирование 56
2.10. Подбор SCAR-праймеров и амплификация с ними 57
2.11. Синтез праймеров 57
2.12. Выделение ДНК для блотт-гибридизации по Саузерну 58
2.13. Блот-гибридизация по Саузерну 59
2.14. Анализ последовательностей специфических SCAR-фрагментов 60
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Характеристика сомаклонов 61
3.2. RAPD-анализ: первая серия опытов 63
3.3. Воспроизводимость RAPD- и ISSR-спектров 65
3.4. RAPD- и ISSR-анализ: вторая серия опытов 67
3.5. Количественная оценка RAPD- и ISSR-полиморфизма 69
3.6. SCAR-аналиэ 73
3.7. Наследование SCAR-маркеров 76
3.8 Анализ нуклеотидных последовательностей SCAR-маркеров 80
3.9, Блот-гибридизация 94
3.10 Секвенирование участка гена анодной пероксидазы кукурузы (ZmApl) 95
Заключение 102
Выводы 104
Список литературы 105
