Введение
Обзор литературы 11
2.1. Семейство натрийуретических пептидов 11
2.1.1. Открытие натрийуретических пептидов 11
2.1.2. Натрийуретический пептид В-типа — представитель семейства натрийуретических пептидов 12
2.2. Синтез и секреция BNP 14
2.2.1. Структура гена BNP 14
2.2.2. Экспрессия BNP в различных тканях 14
2.2.3. Регуляция секреции и экспрессии BNP 15
2.3. Процессинг молекул-предшественников BNP 17
2.3.1. Семейство конвертаз прогормонов 17
2.3.2. Экспрессия и процессинг молекул-предшествинников BNP 18
2.3.3. Фурин и корин — потенциальные конвертазы, осуществляющие процессинг молекул-предшественников BNP 19
2.4. Посттрансляционные модификации proBNP и NT-proBNP 23
2.4.1. Представления о существовании олигомерных форм proBNP и NT-pro BNP 23
2.4.2. ProBNP и NT-proBNP как О-гликопротеины 24
2.4.3. О-гликозилирование — наиболее распространенный тип посттрансляционных модификаций белков 26
2.5. Рецепторы натрийуретических пептидов 28
2.5.1. Семейство рецепторов натрийуретических пептидов 28
2.5.2. Активация и десенситизация рецепторов 30
2.6. Метаболизм BNP в кровотоке 32
2.7. Физиологическое действие BNP 34
2.7.1. Действие BNP на почки 34
2.7.2. Действие BNP на сердечно-сосудистую систему 34
2.7.3. Действие на эндокринную систему 35
2.8. BNP — диагностический и прогностический биохимический маркер состояния
сердечной недостаточности 35
2.8.1. Сердечная недостаточность. Общая характеристика 35
2.8.2. Патофизиология СН 37
2.8.3. Терапевтическое применение натрийуретических пептидов 38
2.8.4. Диагностика СН 41
2.8.5. Измерение концентрации BNP и NT-proBNP в крови 44
2.9. Процессинг молекул-предшественников BNP — возможный регуляторный механизм содержания активной формы BNP в крови 46
2.9.1. Формы BNP в крови 46
2.9.2. ProBNP - превалирующая форма в крови больных с СН 48
2.9.3. Эндокринный парадокс 49
3. Материалы и методы 51
3.1. Материалы 51
3.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований 51
3.1.2. Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований 52
3.2. Методы исследования 53
3.2.1. Иммунохимические и биохимические методы 53
3.2.1.1. Прямой гшмуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Общие принципы .53
3.2.1.2. Коныогирование антител 55
а) Конъюгирование антител с пероксидазой хрена 55
б) Конъюгирование антител со стабильным хелатом европия 57
в) Конъюгирование антител с производным биотина 58
3.2.1.3. Прямой иммупоферментный анализ 58
3.2.1.4. Прямой иммупофосфоресцентный анализ 59
3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа 59
3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа с направленной сорбцией антител на планшете 60
3.2.1.6. Иммобилизация антител на CNBr — активированной сефарозе 60
3.2.1.7. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН в трис-трициновой буферной системе 62
3.2.1.8. Вестерн-блоттинг 63
3.2.1.9. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране 63
а) Визуализация белковых полос с помощью хромогенного субстрата диаминобензидина 64
б) Визуализация белковых полос с использованием метода усиленной хемилюминесценции (Enhanced Chemioluminescence, ECL) 64
3.2.1.10. Экстракция и иммунопреципитация proBNP с использованием аффинного носителя 64
а) Экстракция proBNP из объединенной плазмы больных СН 64
б) Экстракция рекомбинантного proBNP из объединенной кондиционированной среды 65
в) Микроэкстракция proBNP методом аффинной хроматографии 65
г) Иммунопреципитация proBNP 65
3.2.1.11. Хроматографическое разделение белков 66
а) Ионообменная хроматография 66
б) Гель-фильтрация 67
в) Обратно-фазовая хроматография 67
3.2.1.12. Ферментативное дегликозилирование proBNP 67
3.2.1.13. Химическое дегликозилирование рекомбинантного proBNP, экспрессированного в клетках НЕК 293 68
3.2.1.14. Расщепление proBNP рекомбинантным фурином in vitro 69
а) Расщепление рекомбинантного proBNP 69
б) Расщепление эндогенного proBNP 69
3.2.1.15. Масс-спектрометрический анализ 69
3.2.2. Молекулярно-биологические методы 70
3.2.2.1. Получение молекулярно-генетической конструкцииpCMV/proBNP для экспрессии рекомбинантного proBNP в клетках млекопитающих 70
3.2.2.2. Получение молекулярно-генетических конструкций для экспрессии мутантиых форм proBNP. 70
3.2.3. Клеточно-биологические методы 71
3.2.3.1. Культивирование клеточных линий НЕК 293, СНО-К1, NIH ЗТЗ 71
3.2.3.2. Транзиторная трансфекция эукариотических клеточных линий 71
CLASS 4. Результаты исследования и их обсуждение 7 CLASS 4
4.1. Сравнение профилей иїимунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP 74
4.2. Создание молекулярно-генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного proBNP в линиях клеток млекопитающих 81
4.3. Экспресиия rec-proBNP в клеточной линии НЕК 293 82
4.3.1. Оценка уровня экспрессии rec-proBNP 82
4.3.2. Определение оптимального времени культивирования клеток НЕК 293 после
проведения трансфекции 85
4.3.3. Анализ форм rec-proBNP в кондиционированной среде клеток линии НЕК 293, трансфицированных конструкцией pCMV/proBNP 86
4.4. Степень гликозилирования участка 63-76 rec-proBNP и уровень процессинга 88
4.4.1. Иммунореактивностъ rec-proBNP и rec-NT-proBNP, экспрессированных в клеточных линиях СНО-К1 и NIH ЗТЗ 88
4.4.2. Уровень процессинга rec-proBNP при экспрессии в клеточных линиях НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ 90
4.5. Получение очищенного препарата rec-proBNP, экснрсссированного в клеточной линии НЕК 293 92
4.5.1. Выделение и очистка rec-proBNP (НЕК 293) 92
4.5.2. Характеризация очищенного препарата rec-proBNP (НЕК 293) 93
4.6. Влияние гликозилирования участка, расположенного вблизи сайта
процессинга, на расщепление proBNP конвертазой прогормонов фурином 97
4.6.1. Расщепление rec-proBNP, экспрессированного в клетках НЕК293, рекомбинантнъш фурином 97
4.6.2. Расщепление эндогенного proBNP рекомбинантнъш фурином 100
4.7. Процессинг мутантных форм rec-proBNP (НЕК 293) 103
4.7.1. Сканирующийаланиновыймутагенез 103
4.7.2. Оценка уровня процессинга мутантных форм rec-proBNP... 104
4.7.3. Исследование процессинга rec-proBNP дикого типа и формы Т71А с использованием метода гель-фильтрации 106
4.7.4. Исследование BNP, образующегося при процессинге мутантной формы гес-proBNP Т71А, с использованием метода масс-спектрометрии 107
4.8. Анализ филогенетической консервативности феномена ингибирования процессинга proBNP под действием гликозилирования 108
Заключение ПО
Выводы 112
Благодарности ИЗ
Список цитируемой литературы 114
